Ensaios Radiométricos de Ligaduras Ligand-Binding | Base de Conhecimento de Suporte de Aplicação | Produtos e Serviços de Laboratório | PerkinElmer

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Overvisão

Ligandos radioativos são comumente usados para medir ligaduras ligand binding para receptores. Neste ensaio, você medirá a ligação de um ligante radiolabelado a células ou membranas celulares contendo um receptor de interesse. Tanto células inteiras como membranas celulares podem ser usadas para este ensaio. Os radioligandos podem ser usados para realizar curvas de saturação, competição e experimentos cinéticos.

Ligand-receptor binding

Ao selecionar uma radioligand, há alguns fatores a ter em mente:

• Alta atividade específica: Radioligandas com uma alta actividade específica são bem adequadas para ensaios de ligadura. A actividade específica indica quanta radioactividade existe por molécula de ligante, e é normalmente dada em unidades de Curies por milimole de ligante. Vários dos nossos ligandos marcados com 125I são oferecidos com a máxima actividade específica (2200 Ci/mmol se um local de marcação 125I estiver disponível, 4400 Ci/mmol se dois locais de marcação 125I estiverem disponíveis, etc.). Isto indica que praticamente todas as moléculas de ligante fornecidas no frasco de stock são radioligadas. Para os ligandos tritiados (ligandos 3H), o ideal é escolher um ligando que tenha uma actividade específica acima de 20 Ci/mmol. A actividade específica teórica máxima por trítio é de 29 Ci/mmol (Curies per millimole of tritium). As actividades específicas acima deste valor indicam que, em média, cada molécula de ligante tem pelo menos um trítio.
• Ligação não específica baixa: Os ligandos hidrofóbicos geralmente apresentam uma ligação não específica mais elevada. Isto pode às vezes ser compensado pelo revestimento de filtros com BSA para reduzir a ligação não-específica. A inclusão de BSA, sais ou detergentes no tampão de lavagem ou de ligação também pode ajudar a reduzir a ligação não específica. Se o material radioquímico em estoque for embalado em um frasco silanizado (consulte a folha de dados técnicos), isso pode indicar que o ligante é um pouco hidrofóbico
• Alta pureza: Idealmente, o ligante deve ter uma pureza radioquímica acima de 90%. A pureza radioquímica diminui com o tempo, e a taxa real desta degradação acelera com o tempo. A pureza radioquímica e as taxas de degradação para nossos vários radioquímicos podem ser encontradas nas fichas técnicas específicas do lote.
• Alta seletividade: Quanto mais selectivo for o ligante para o seu receptor, melhores serão os seus dados. A alta seletividade indica que o ligante será reconhecido principalmente por apenas um receptor de interesse, sobre outros receptores que possam estar presentes em uma membrana celular. Além disso, o uso de membranas que expeçam em excesso o receptor de interesse pode ajudar a reduzir qualquer potencial contribuição de receptores endógenos expressos na membrana.
• Estabilidade: Se você precisar usar sua radioligand durante um longo período de tempo, a estabilidade pode ser um fator para você. Os ligandos marcados com 125I devem geralmente ser usados dentro de um a dois meses após a data de fabricação. Os ligandos marcados com 125I devem geralmente ser usados dentro de 3 a 6 meses da data de fabricação; no entanto, há exceções a isso. As taxas de degradação e as datas de fabrico podem ser encontradas nas nossas fichas técnicas de lotes específicos. Você também pode entrar em contato com o suporte técnico para discutir o tempo de uso recomendado para cada radioquímico PerkinElmer – nossas informações de contato estão no canto superior direito desta página.
• Energia: 3H libera energia beta, que pode ser medida em um contador de cintilação após a adição de cintilante (na forma de um coquetel de cintilação, um cintilante sólido Meltilex®, uma conta de SPA, etc.). A energia beta interage com o cintilante para produzir fótons, que são medidos pelo detector. 125I liberta tanto a energia beta como a energia gama. Se você só tem acesso a um contador gama, você deve usar uma radioligand rotulada com 125I. Um fator adicional é o formato do ensaio. O 125I liberta mais energia do tipo beta do que o 3H. Para ensaios de SPA, os ligandos marcados com 3H ou 125I podem ser usados eficazmente.

A ensaios de ligação de ligandos radioactivos podem ser realizados em vários formatos diferentes. Normalmente, realizamos este ensaio em formato de filtragem, mas o ensaio também pode ser realizado em formato SPA. O formato SPA é um formato homogêneo, o que significa que não são necessários passos de lavagem. No ensaio de filtração, você lavará o ligante não ligado usando um coletor de vácuo ou uma colhedora de células.

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Formatos de ensaio

Avaliações de ligação de ligantes de filtragem

Veja mais informações sobre quais materiais você precisa, quais otimizações você pode precisar realizar, e referências para ensaios de ligação de ligantes de filtragem de placas radioativas. No formato de filtração, o ensaio de ligação é realizado primeiro numa placa de ensaio, depois filtrado através de um filtermat ou placa UniFilter® utilizando uma segadora de células (colector de vácuo). Os filtros são lavados para remover qualquer radioligandria não ligada. O filtermat ou placa UniFilter é então seco e o coquetel de cintilação (ou Meltilex®) é adicionado antes da leitura em um detector apropriado.

ensaios de ligação de ligantes SPA

Veja mais informações sobre quais materiais você precisa, quais otimizações você pode precisar realizar e referências para ensaios de ligação de radioligand SPA. No formato SPA, as membranas celulares são capturadas nos grânulos de SPA. Quando a radioligand se liga ao receptor/membrana, isto coloca a radio-química na proximidade do grânulo de SPA. A energia beta da radioligand pode interagir com o cintilante no grânulo, produzindo um sinal que pode ser medido. A radioligand que não está ligada à membrana celular não estará suficientemente perto do grânulo de SPA para interagir fortemente com o cintilante.

Visão geral da ligação dos ligandos

Definições

Afinidade (potência): a tensão com que o ligando se liga ao receptor. Isto é normalmente expresso como uma constante de equilíbrio, Kd. Quanto menor o valor de Kd, maior a afinidade.
• Especificidade: descreve como um ligando é seletivo para um receptor em relação a outros receptores similares
• Kd: A concentração onde 50% dos receptores são ocupados por radioligand

Classificações Farmacológicas para Ligandos

Ligandos

• Agonista total: um ligando que se liga e ativa um receptor e aciona uma resposta máxima
• Agonista parcial: um ligando que se liga a um receptor e produz uma resposta sub-máxima
• Antagonista: um ligando que se liga a um receptor que não ativa o receptor. Os antagonistas não disparam nenhuma resposta quando aplicados por si mesmos. Eles bloquearão os efeitos de um ligando agonista concorrente.
• Agonista inverso: um ligando que se liga a um receptor e diminui a resposta abaixo do nível basal

Avaliações

I. Experiência de Saturação: Mede o equilíbrio de ligação realizando uma titulação de radioligand, mantendo a quantidade de receptor constante.

Pode usar curvas de saturação para determinar Bmax (nível de expressão do receptor) e Kd (afinidade de ligação do ligando).

Experimento de saturação

• Ligação total: Aumento da concentração de radioligand na ausência de ligand frio. Mede tanto a ligação específica ao receptor, como a ligação não específica.
• Ligação não específica: Aumento da concentração de radioligand na presença de ligante frio. Mede a ligação da radioligand a componentes não-receptores.
• Ligação específica: Ligação total menos ligação não específica. Mede a ligação ao receptor, especificamente.

II. Experiência de competição: Mede a ligação de equilíbrio de uma única concentração de radioligand na presença de várias concentrações de um concorrente não rotulado.

Você pode usar curvas de competição para determinar a afinidade de um grande número de compostos não rotulados para um receptor na triagem. IC50 e Ki podem ser derivados dos dados da competição.

Curva de competição

• IC50: Concentração de um ligando concorrente que desloca metade do ligando radioativo
• Ki: afinidade de um ligando frio para o receptor

Nota: Ao mudar a concentração de radioligand, uma mudança no IC50 de um composto de referência pode ser observada; entretanto, o Ki permanece o mesmo.

III. Experimentos cinéticos: Meça o nível de ligação em vários momentos para determinar as constantes de taxa para associação e dissociação da radioligand.

Cinética

• Saturating concentration of ligand added an amount bound over time to determine the Kon
• Alta concentração de competidor sem rótulo adicionada e diminuição da ligação ao longo do tempo medida para determinar o Koff

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Dicas e FAQs

Idealmente, você vai querer selecionar uma radioligand que tenha as seguintes propriedades:

• Alta actividade específica (> 20 Ci/mmol para um ligando triado)
• Baixa ligação não específica (os ligandos hidrofóbicos geralmente apresentam uma ligação não específica mais elevada)
• Alta pureza (normalmente > 90% de pureza)
• Alta selectividade
• Estabilidade (se necessitar de utilizar a sua radioligand durante um período de tempo prolongado, a estabilidade pode ser um fator. Os ligandos marcados com 125I devem geralmente ser utilizados dentro de um a dois meses após a data de fabrico. Os ligandos marcados com 125I devem geralmente ser usados dentro de 3 a 6 meses da data de fabricação (no entanto, há exceções).

Ao plotar seus dados, recomendamos que você use a concentração experimentalmente determinada de suas soluções de trabalho radioligandas, em vez de uma concentração calculada. Algumas radioligandas irão aderir às paredes dos seus tubos de diluição. É importante determinar a verdadeira concentração da sua radioligandas pipetadas. Para determinar experimentalmente a concentração de uma radioligand diluição, pipete alguns microlitros do seu tubo de diluição e coloque uma mancha num material filtrante. Você também pode querer detectar uma diluição de 1/10 desta amostra, para que você possa verificar os seus resultados. Determine os dpms (desintegrações por minuto). Converta de dpms para Curies usando a seguinte equação:

1 Ci = 2.22 x 1012 dpm

Então use a actividade específica do seu lote de radioligand para converter de Curies para moles. Para determinar a concentração radioativa neste ponto, divida o número de toupeiras pelo volume que você avistou no filtermat.

FAQs

Q. Que concentração de radioligand devo usar na minha curva de saturação?
A. Geralmente recomendamos que você escolha 3-5 concentrações abaixo do Kd, e 3-5 concentrações acima do Kd. A concentração mais alta deve ser dez vezes a Kd.

Q. Qual a concentração de radioligand que deve ser selecionada para ligação competitiva?
A. A radioligand é usada em baixa concentração, geralmente no valor de Kd ou abaixo dele. Se a atividade específica for baixa, concentração acima do valor Kd pode ser usada, mas nunca deve estar em ou acima da concentração saturadora.

Q. Que tipo de ligante devo usar para determinar ligação não específica nas minhas curvas de saturação?
A. Você normalmente quer escolher um ligando que seja diferente da sua radioligand. Você quer deslocar apenas a ligação específica da radioligand para o receptor. Você deve escolher um ligando que tenha alta afinidade para o local de ligação do receptor e baixa afinidade para locais de ligação não específicos.

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