Doxiciclina é anti-inflamatória e inibe as exotoxinas estafilocócicas-Citocinas Induzidas e Quimiocinas

Toxina 1 da síndrome do choque tóxico estafilocócica (TSST-1) e as exotoxinas estruturalmente relacionadas são exotoxinas bacterianas que se ligam directamente às moléculas principais do complexo de histocompatibilidade classe II em células que apresentam antígenos (1, 5, 8, 18, 23) e activam células T que exprimem elementos Vβ específicos (7). Estas toxinas são chamadas superantigénios devido à sua capacidade de estimular policlonalmente grandes populações de células T (1, 4, 7, 14). Assim, as exotoxinas estafilocócicas (SE) são potentes ativadores do sistema imunológico e causam uma variedade de doenças em humanos, incluindo intoxicações alimentares, choque tóxico e doenças auto-imunes (1, 2, 6, 12, 14, 22). As suas interacções com células do sistema imunitário resultam na produção massiva de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias (1, 4, 15, 17). As citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 (IL-1) e interferon gama (IFN-γ) são mediadores chave no choque tóxico induzido por superantigênio (1, 21). Tanto a TNF-α como a IL-1 têm atividades imunoestimulantes potentes e agem sinergicamente com a IFN-γ para melhorar as reações imunológicas e promover lesões teciduais (16). Consequentemente, essas citocinas são patogênicas em altas concentrações in vivo e são responsáveis por febre e choque tóxico induzido pela SE (13, 14, 18, 19).

Doxiciclina é um antibiótico de amplo espectro amplamente utilizado para infecções causadas por microrganismos gram-negativos e gram-positivos. Actua como agente bacteriostático e é altamente eficaz contra muitos microrganismos, incluindo Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis, e Yersinia pestis. A doxiciclina pertence à família dos antibióticos tetraciclina, cujos membros têm demonstrado ter outras acções biológicas independentes dos seus efeitos antimicrobianos (10). A doxiciclina inibe a forbol-12-miristato-13-acetate-mediated metalloproteinase 8 (MMP-8) e MMP-9 em células endoteliais humanas (11). A doxiciclina também diminui a degradação da elastina e reduz a atividade da MMP em um modelo de doença aneurismática (3). Mais recentemente, a doxiciclina demonstrou inibir a produção de IL-1β em culturas de epiteliais córneas tratadas com lipopolissacarídeos em um grau comparável ao alcançado pelos corticosteróides (25). In vivo, a doxiciclina protegeu ratos da endotoxemia letal através da diminuição da regulação da secreção de citocina e nitrato no sangue (20). Este estudo foi realizado para determinar o efeito modulatório da doxiciclina sobre a ativação de células T induzidas por estafilococos superantigênio e a produção de citocinas a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).

Human PBMC foram isoladas por centrifugação do sangue heparinizado de doadores humanos normais por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. As PBMC (106/ml) foram cultivadas a 37°C em placas de 24 poços contendo meio RPMI 1640 e 10% de soro fetal bovino ativado por calor. As células foram incubadas com SEB (200 ng/ml) ou TSST-1 (200 ng/ml) durante 16 h, e os sobrenadantes foram colhidos e analisados para IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α, e MIP-1β. As citocinas e quimiocinas foram medidas por um ensaio imunoenzimático com anticorpos específicos da citocina ou quimiocina, de acordo com as instruções do fabricante (15, 17). As citocinas e quimiocinas recombinantes humanas (20 a 1.000 pg/ml) foram usadas como padrões para calibração em cada placa. O limite de detecção de cada ensaio foi de 20 pg/ml. Os dados de citocinas e quimiocinas foram expressos como a leitura média ± o desvio padrão (DP) de amostras duplicadas. A doxiciclina, quando presente, foi adicionada simultaneamente com o agente estimulante. A citotoxicidade foi medida pela liberação de desidrogenase láctica (LDH) do citosol em sobrenadante de cultura. A LDH foi quantificada usando um kit de ensaio de citotoxicidade colorimétrica (Boehringer Mannheim) conforme instruções do fabricante. A quantidade máxima de LDH liberável (100%) foi obtida através da lisagem de células com 1% de Triton X-100. A proliferação de células T foi testada com PBMC (105/poço), as quais foram plaqueadas em triplicado com SEB ou TSST-1 (200 ng/ml), com ou sem doxiciclina, durante 48 h a 37°C em placas de microtitulação de 96 poços. As células foram pulsadas com 1 μCi de timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) por poço durante as últimas 5 h de cultura, conforme descrito anteriormente (15). As células foram colhidas em filtros de fibra de vidro, e a timidina incorporada foi medida por cintilação líquida. Todos os dados foram analisados para diferenças significativas pelo teste t de Student’s com Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). As diferenças entre os grupos controle tratados e não tratados com doxiciclina foram consideradas significativas se P foi <0,05,

Com base no relato de que a doxiciclina bloqueou a IL-1 induzida por lipopolissacarídeos em células epiteliais e preveniu a endotoxemia letal in vivo (20,25), testamos a hipótese de que este antibiótico poderia ter efeitos diretos sobre as citocinas induzidas pelo SE. Como mostrado na Fig. 1, a dose de doxiciclina inibiu de forma dependente a produção das citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α e IFN-γ e das quimiocinas MCP-1, MIP-1α e MIP-1β pela PBMC incubada com SEB. Redução semelhante de citoquinas e quimiocinas dependente da dose por doxiciclina também foi observada para PBMC estimulado por TSST-1 (dados não mostrados). O efeito inibitório da doxiciclina sobre as citocinas mediadas por SEB ou TSST-1 e quimiocinas obtidas com PBMC de sete doadores normais está resumido na Fig. 2. A produção de MCP-1 e IFN-γ foi completamente bloqueada por 50 μM doxiciclina. Esta concentração de doxiciclina reduziu IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α e MIP-1β para 15 a 22%, 37 a 41%, 21 a 25%, 10 a 15% e 59 a 61% da de células não tratadas, SEB- ou TSST estimuladas, respectivamente. A TNF-β, quando presente, também foi inibida para 25% da das células não tratadas estimuladas por SEB. A doxiciclina não era citotóxica para PBMC nesta concentração, medida pela exclusão do azul tripano e pela ausência de libertação de desidrogenase láctica das células tratadas. A inibição completa destas citocinas e quimiocinas foi observada em altas doses de doxiciclina (>0.1 mM). Inibição similar da dose-resposta pela doxiciclina foi observada em concentrações menores de SEB (1 e 10 ng/ml) (dados não mostrados).

Por causa dos superantigenos também causarem proliferação de células T, o efeito da doxiciclina sobre a proliferação de células T induzida pela SE foi investigado. A Figura 3 mostra que a doxiciclina inibiu a proliferação de células T estimuladas por SEB e TSST-1 de forma dose-dependente, alcançando 98% de inibição a 0,05 mM.

Este estudo demonstrou que a doxiciclina efetivamente inibiu a produção de superantigênio mediado por citocinas e quimiocinas por PBMC humano in vitro. A proliferação de células T induzida por superantigénios estafilocócicos também foi completamente suprimida. A desregulação das citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias pela doxiciclina em PBMC estimulada por SEB e TSST-1 sugeriu que a doxiciclina pode afetar a fisiopatologia do choque tóxico. Estes achados ampliam as observações de outros investigadores sobre os efeitos imunomoduladores da doxiciclina além de suas atividades antimicrobianas.

Multiplos mecanismos moleculares, tanto transcripcionais quanto pós-transcripcionais, podem estar envolvidos nos efeitos antiinflamatórios da doxiciclina (11, 26). A supressão das citocinas pró-inflamatórias pode envolver a desregulação da via PKC pela doxiciclina, como sugerido por um estudo de seus efeitos na formação do granuloma (26). A dose inibitória relatada de doxiciclina (10 a 15 μM) que reduz colagenase, gelatinase e outras metaloproteinases in vitro (10, 11) é comparável à utilizada neste estudo e é várias vezes maior do que a observada no soro humano após dose oral de 200 mg diários (10, 24). Entretanto, estudos clínicos indicam que essa dose foi suficiente para reduzir as atividades de colagenase e gelatinase em extratos de cartilagem osteoartrítica humana ex vivo (24). Uma dose subantimicrobiana de doxiciclina (20 mg duas vezes ao dia) mostrou inibir a atividade da colagenase fluida gengival (9). Além disso, estudos in vivo de endotoxemia experimental também encontraram a doxiciclina e outras tetraciclinas eficazes na desregulação de citocinas inflamatórias e na prevenção do choque (20).

Em conclusão, os resultados aqui apresentados indicam que a doxiciclina desregula as citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, sugerindo assim sua potencial utilidade no tratamento do choque tóxico induzido por superantigênio. Em um cenário clínico quando o hospedeiro é exposto a múltiplos agentes biológicos, incluindo bactérias e exotoxinas bacterianas, o uso da doxiciclina oferece uma vantagem adicional de proporcionar efeitos antimicrobianos e antiinflamatórios.