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DIAGNÓSTICO DE DEFICIÊNCIA DE ALFA-1-ANTITRIPOSINA POR ANÁLISE DE ADN DE CRIANÇAS COM DOENÇA VIVA*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 e Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Background – Alpha-1-antitrypsin deficiency is a genetic disorder which is transmitted in a co-dominant, autosomal form. A deficiência de alfa-1-antitripsina afeta principalmente os pulmões e o fígado, levando, neste último caso, à colestase neonatal, hepatite crônica ou cirrose. O diagnóstico preciso da deficiência de alfa-1-antitripsina pode ser obtido por meio de análises bioquímicas ou moleculares. Objetivo – O objetivo deste estudo foi utilizar a análise de DNA para examinar a presença de deficiência de alfa-1-antitripsina em 12 crianças suspeitas de terem essa deficiência e que apresentaram características laboratoriais e clínicas da doença. Pacientes e Métodos – Foram estudados 12 pacientes, com idades entre 3 meses e 19 anos, que apresentavam níveis séricos de alfa-1-antitripsina inferiores ao normal e/ou que apresentavam doença hepática de etiologia indefinida. Os alelos S e Z mutantes do gene da alfa-1-antitripsina foram investigados nas 12 crianças. A organização do gene da alfa-1-antitripsina foi analisada pela amplificação do genoma através da reação em cadeia da polimerase e digestão com as enzimas de restrição Xmnl (alelo S) e Taq 1 (alelo Z). Resultados – Sete dos 12 pacientes tinham doença hepática crônica de etiologia indefinida e os outros cinco pacientes tinham níveis séricos baixos de alfa-1-antitripsina, assim como um diagnóstico de colestase neonatal e/ou doença hepática crônica de etiologia indefinida. Cinco dos 12 pacientes eram homozigotos para o alelo Z (ZZ) e dois tinham o alelo S com outro alelo (*S) diferente do Z. Conclusão – Estes resultados mostram que a deficiência de alfa-1-antitripsina é relativamente frequente em crianças com doença hepática crônica de etiologia indefinida e/ou baixos níveis de alfa-1-antitripsina (41,6%). Um diagnóstico correto é importante para um acompanhamento clínico eficaz e para o aconselhamento genético.

HEADINGS ¾ Deficiência de alfa-1-antitripsina. Diagnóstico molecular. Biópsia hepática.

INTRODUÇÃO

Alpha-1-antitripsina (A1AT) é uma glicoproteína de 52 kDa produzida principalmente por hepatócitos que liberam 2 g desta proteína, por dia, na corrente sanguínea(36). A principal função da A1AT é inibir a ação da elastase neutrofílica, uma protease serina que hidrolisa as fibras de elastina nos pulmões(38). Mutações na codificação gênica para A1AT produzem uma proteína sem capacidade inibitória e podem levar ao acúmulo de A1AT em corpúsculos de inclusão em hepatócitos, reduzindo assim os níveis séricos normais desta proteína(4). Esta deficiência é refletida como enfisema pulmonar, bronquite crônica ou bronquiectasia(9). O acúmulo de A1AT mutante em hepatócitos também pode levar à colestase neonatal, hepatopatia crônica ou cirrose(33, 34).

O gene A1AT é altamente polimórfico, co-dominante e está localizado no braço mais longo do cromossomo 14 (14q 31-32,3)(20, 29). Seventy¾five alelos (designados A-Z de acordo com seus pontos isoelétricos) foram descritos para este gene baseado no foco isoelétrico do soro entre pH 4 (anodo) e pH 5 (catodo) em géis de poliacrilamida. As variantes comuns migram para o centro do gel e, portanto, pertencem à família M (“middle”). Uma variante deficiente, originalmente descrita por LAURELL e ERIKSSON em 1963(21), migra para o cátodo e é denominada Z. Outra variante, que se move lentamente no gel, é denominada S(5). Este “locus” polimórfico é geralmente conhecido como o sistema Pi (inibidor de protease). A maioria das variantes produzem A1AT de quantidade e qualidade normais(7, 8, 25). Entretanto, alguns alelos como as variantes S e Z estão associados a uma condição deficiente que atinge frequências polimórficas como populações caucasianas e casos de alelo nulo em que a produção de proteína é totalmente ausente têm sido relatados(10).

O alelo S resulta da substituição da adenina pela tiamina no exon III do gene, o que leva à troca do ácido glutâmico na posição 264 por valina e a conseqüente formação de uma estrutura protéica instável(10, 11, 19). O alelo Z resulta da substituição da guanina na posição 342 pela adenina no exon V do gene e leva à formação de uma proteína que se acumula na superfície rugosa interna do retículo endoplasmático hepatócito(6). O diagnóstico de uma condição deficiente é geralmente feito após quantificação dos níveis séricos da proteína junto com o perfil eletroforético após focalização isoelétrica(23, 37). Um diagnóstico mais preciso requer análise gênica utilizando técnicas baseadas em DNA(12, 14, 26).

O objetivo deste estudo foi identificar portadores de alelos S e Z em pacientes suspeitos de terem esta deficiência e que apresentaram características laboratoriais e clínicas desta doença.

PATIENTES E MÉTODOS

Patientes

No período de fevereiro de 1988 a agosto de 1997, um grande número de pacientes foi encaminhado ao Serviço de Gastroenterologia Pediátrica da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil, com o objetivo de investigar doenças hepáticas. Deste número apenas 12 pacientes não apresentaram diagnóstico definitivo (resultados negativos para hepatite viral, hepatite auto-imune e doença de Wilson). Esses pacientes foram submetidos a uma análise molecular da A1AT.

Métodos

1 ¾ Protocolo de estudo

2 – Biópsia hepática

Biópsias hepáticas percutâneas foram obtidas conforme descrito pelo MOWAT(24) utilizando anestesia local em pacientes em jejum de pelo menos 4 h, com venoclise e actividade protrombínica normal. O fragmento obtido foi imediatamente colocado em formalina a 10% e depois processado e corado com hematoxilina-eosina, tricrómica de Masson, azul da Prússia e impregnação das fibras reticuladas com prata. A coloração especial foi obtida com PAS (acid-Schiff periódico), seguida de tratamento com diastase. A persistência de grânulos citoplasmáticos eosinofílicos mesmo após o uso de diastase foi considerada positiva para deficiência de A1AT.

3 – Análise molecular

Para investigar os alelos S e Z mutantes do A1AT, foi feita uma extração de DNA de leucócitos do sangue periférico, conforme método descrito por WOODHEAD et al.

RESULTADOS

Cinco das 12 crianças estudadas eram homozigotos Z (ZZ) enquanto duas das crianças tinham o alelo S junto com outro alelo que não era Z (*S). A Tabela 1 mostra a idade do paciente no momento da coleta de sangue e a indicação usada para decidir para análise posterior. Três dos pacientes apresentaram colestase neonatal como uma manifestação inicial de hepatopatia crônica.

Os cinco pacientes com genótipo ZZ apresentaram níveis séricos reduzidos de A1AT e a biópsia hepática mostrou cirrose (um), hepatite neonatal (dois), uma escassez de ductos biliares interlobulares (um) e hepatite crônica (um). Neste último caso (FSP), foram observados grânulos citoplasmáticos eosinofílicos em hepatócitos periportais após coloração com HE e posteriormente confirmados pela positividade de PAS e resistência à diastase (Figura 1). Os dois pacientes com colestase neonatal (EKBA e RHBP) foram submetidos a uma biópsia hepática com 10 e 13 semanas de idade, respectivamente, e apresentaram glóbulos eosinofílicos PAS-positivos e resistentes à diástole.

Figuras 2 e 3 mostram os resultados da amplificação e digestão dos alelos S e Z, respectivamente.

DISCUSSÃO

A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma das doenças genéticas mais comuns que levam à doença hepática em crianças e é a doença genética mais comum que requer transplante hepático(17, 28). A deficiência de A1AT afeta 1 de 1600-2000 neonatos na América do Norte e Norte da Europa(28, 31), mas apenas 10-15% da população com essa deficiência desenvolvem doenças hepáticas(32, 33). De acordo com um estudo publicado pela SVEGER em 1988(33), durante o período neonatal 11% dos pacientes com o fenótipo PIZZ desenvolvem hepatite ictérica. Neste estudo, três pacientes com diagnóstico de deficiência de A1AT apresentaram colestase neonatal e em dois deles, antes do diagnóstico definitivo da deficiência ser estabelecido, a colestase foi considerada idiopática. Cinco a 10% dos casos de hepatite neonatal idiopática relatados na literatura são causados por uma deficiência de A1AT(3).

Em cinco pacientes com esta deficiência estudada, os níveis séricos de A1AT estavam abaixo do limite inferior normal. Entretanto, este exame não confirmou absolutamente o diagnóstico da doença. Como a A1AT é uma proteína da fase inflamatória aguda, sua síntese aumenta em condições inflamatórias/infecciosas, neoplasia, gravidez e durante a terapia com estrogênios e corticosteróides(16,22). A redução dos níveis séricos de A1AT ocorre na síndrome de angústia respiratória dos neonatos, na fase terminal da insuficiência hepática, na fibrose cística e em situações em que há grande perda protéica(15). Os níveis séricos nos genótipos SZ, que teoricamente poderiam resultar em doenças hepáticas, geralmente são normais.

Quando a colestase neonatal está presente, é fundamentalmente necessário um diagnóstico diferencial com atresia biliar extra-hepática. A história clínica permite um diagnóstico adequado em 83% dos casos(1) e são necessárias investigações específicas para melhorar a precisão do diagnóstico. Dentre essas investigações, a biópsia hepática é de grande importância. As alterações histopatológicas observadas na biópsia hepática de pacientes com deficiência de A1AT podem ser as mesmas observadas na hepatite neonatal idiopática ou em casos de atresia biliar extra-hepática(24). A presença de glóbulos predominantemente periportais, intrahepatocísticos, que são fortemente PAS positivos após a digestão da diastase é uma indicação útil da deficiência de A1AT(13, 18, 27). Entretanto, é difícil identificar estes glóbulos antes da 12ª semana após o nascimento(35). Neste estudo, a paciente EKBA apresentava glóbulos com as características acima descritas no tecido hepático aos 10 semanas de idade. Não foram vistos tais glóbulos na paciente JCI (13 semanas de idade). Estes resultados sugerem que a presença de glóbulos deve ser investigada usando coloração especial em fragmentos hepáticos obtidos antes da 12a semana de idade, embora um resultado negativo não elimine a possibilidade de deficiência de A1AT. A análise bioquímica não foi utilizada neste estudo, pois a análise de DNA, que é mais precisa, foi possível.

Uma deficiência de A1AT é relativamente freqüente em crianças que apresentam doença hepática de etiologia indefinida. Este diagnóstico é subestimado, provavelmente porque são utilizados métodos de diagnóstico imprecisos. A análise molecular fornece um diagnóstico mais preciso e também pode ser útil para o aconselhamento genético de pacientes com doença hepática de etiologia desconhecida.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. As manifestações clínicas principais incluem acometimento pulmonar e hepático. Este último, apresenta-se como colestase neonatal, hepatite crônica ou cirrose. O diagnóstico definitivo é realizado pela análise bioquímica da alfa-1-antitripsina ou pela análise molecular. Objetivo – Investigar, em um grupo de 12 crianças com suspeita de deficiência de alfa-1-antitripsina, a presença efetiva da deficiência através da análise de DNA, para um diagnóstico definitivo, bem como a associação entre os deficientes de alfa-1-antitripsina com as características clínicas e laboratoriais encontradas. Casuística e Métodos – Foram investigados os alelos mutantes S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em 12 pacientes com idade variando de 3 meses a 19 anos, encaminhadas pelo ambulatório de Gastroenterologia Pediátrica da Universidade Estadual de Campinas, SP, por apresentarem dosagem sérica de alfa-1-antitripsina inferior ao normal e/ou doença hepática sem etiologia definida. A análise de DNA foi realizada utilizando-se o método modificado de amplificação gênica pela reação em cadeia de polimerase que cria sítios de restrição para as enzimas Xmnl (alelo S) e Taq l (alelo Z). Resultados – Dos 12 pacientes encaminhados, 7 apresentavam doença hepática crônica sem etiologia definida e os outros 5 traziam dosagens séricas baixas de alfa-1-antitripsina acompanhadas do diagnóstico de colestase neonatal e/ou doença hepática crônica de etiologia desconhecida. Nesse grupo de 12 pacientes, foram observados cinco pacientes homozigotos Z (ZZ) e dois traziam o alelo S acompanhado de um outro alelo, diferente do Z (*S). Conclusão – Esses resultados mostram que a deficiência de A1AT é uma etiologia relativamente freqüente em crianças que apresentam doença hepática crônica sem etiologia definida e/ou dosagem sérica baixa de A1AT (41,6%). A importância de um diagnóstico de certeza para a deficiência é justificada não apenas para o seguimento clínico do paciente mas também, em termos de aconselhamento genético.

DESCRITORES ¾ Deficiência de alfa-1-antitripsina. Diagnóstico molecular. Biopsia hepática.

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Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Estudo realizado pelos Departamentos de Pediatria, Genética Médica, Anatomia Patológica e Patologia Clínica da Faculdade de Ciências Médicas (FCM), Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasil.

1 Pós-graduanda. Departamento de Pediatria, FCM/UNICAMP.

2 Professor Assistente. Departamento de Patologia Clínica, FCM/UNICAMP.

3 Professora Assistente. Departamento de Anatomia Patológica, FCM/UNICAMP.

4 Doutoramento em Genética (Instituto de Biologia), UNICAMP.

5 Professora Assistente. Departamento de Genética Médica, FCM/UNICAMP.

6 Professor Assistente. Departamento de Pediatria, FCM/UNICAMP.