Dentificação molecular de espécies de micobactérias de saúde pública e importância veterinária de bovinos no Estado do México Sul

Abstract

Gênero micobactéria causa uma variedade de doenças zoonóticas. O exemplo mais conhecido é o da tuberculose zoonótica devido a M. bovis. Muito menos se sabe sobre “micobactérias não tuberculosas (NTM)”, que também são associadas com infecções em humanos. O padrão mexicano NOM-ZOO-031-1995 regula a presença de M. bovis no gado; no entanto, não existe nenhuma regulamentação para a espécie NTM. O objetivo deste estudo foi isolar e identificar espécies de micobactérias não tuberculosas de bovinos de rebanhos locais na região sul do Estado do México através da identificação e detecção do marcador molecular 100 bp no gene 23S rRNA com seqüenciamento subseqüente do gene 16S rRNA. Amostras de leite (35) e exsudato nasal (68) foram coletadas. Das 108 cepas isoladas, 39 foram selecionadas para identificação. Treze cepas isoladas dos exsudados nasais amplificaram o marcador molecular de 100 bp e foram identificadas como M. neoaurum (seis cepas), M. parafortuitum (quatro cepas), M. moriokaense (duas cepas), e M. confluentis (uma cepa). Com exceção do M. parafortuitum, as outras espécies identificadas são de interesse veterinário e de saúde pública porque são patogênicas para o ser humano, especialmente aquelas com condições médicas subjacentes.

1. Introdução

O gênero Mycobacterium causa uma grande variedade de doenças zoonóticas. O exemplo mais conhecido é a tuberculose zoonótica devido a M. bovis, para a qual o gado é o principal reservatório. M. bovis é parte do “complexo da tuberculose”, que também inclui as espécies M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae, e M. microti .

No grupo das micobactérias estão as “micobactérias não tuberculosas (NTM)”, que também estão associadas com infecções em humanos. As NTM são encontradas em várias fontes ambientais como solo, água, vegetação, animais, produtos lácteos e fezes e podem ser transmitidas inadvertidamente por inalação, ingestão ou penetração na pele .

O padrão mexicano NOM-ZOO-031-1995 regula a presença de M. bovis no gado para controlar e erradicar a tuberculose bovina (bTB); entretanto, não existe regulamentação para a espécie NTM. O diagnóstico oficial da tuberculose bovina devido à presença de M. bovis no campo é baseado no teste intradérmico usando um derivado proteico purificado (tuberculina). Embora usado por vários anos, este teste não fornece boa sensibilidade e especificidade. Aproximadamente 20% dos animais com tuberculose não reagem ao teste , e a presença de outras espécies micobacterianas, tanto do complexo tuberculoso quanto das espécies NTM, causa interferência que leva a diagnósticos falso-positivos e falso-negativos.

Embora o México tenha um padrão regulatório, a prevalência de bTB acima de 2% é relatada em algumas áreas . Dada a baixa especificidade e sensibilidade do teste de tuberculina, a presença real de M. bovis provavelmente será menor e a taxa de infecção do gado por outras micobactérias provavelmente será maior, respectivamente. Assim, criadores de gado, veterinários, técnicos e funcionários que trabalham na indústria pecuária podem estar profissionalmente expostos a infecções por M. bovis e NTM. Muito pouco se sabe sobre a exposição ocupacional a zoonoses devido às espécies NTM porque a identificação dessas espécies era uma tarefa bastante difícil antes do desenvolvimento de técnicas de identificação baseadas na biologia molecular.

Currentemente, as técnicas de biologia molecular mais comumente usadas para o diagnóstico de doenças causadas por micobactérias são o polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) para o diagnóstico de M. bovis. tuberculose , espoligotipagem para o diagnóstico de M. bovis , e a detecção de um par de 100 bases (bp) “inserção específica” localizada no gene 23S rRNA característico das bactérias Gram-positivas com alto teor de guanina-citosina (HGC), que é considerado um marcador molecular para este grupo de bactérias , seguido pela análise da sequência do gene 16S rRNA para a identificação de bactérias a nível da espécie .

As espécies NTM identificadas pelas técnicas acima mencionadas são M. balnei, M. marinum e M. platypoecilus, que têm causado lesões cutâneas superficiais e profundas; M. kansasii de lesões pulmonares; M. simiae de infecções generalizadas; M. scrofulaceum de infecções da pele e órgãos internos; M. szulgai associado a infecções pulmonares, osteomielite, tenossinovite e linfadenite; M. ulcerans associado a granulomas subcutâneos ; M. fortuito e M. chelonae associados a vasculite, endocardite, osteomielite, mediastinite, meningite, ceratite e hepatite ; M. abscesso, associado a lesões eritematosas que progrediram para nódulos ulcerados ; e outras espécies.

A maior porcentagem do inventário estadual de cabeças de gado no Estado do México está concentrada na região sul, e uma das principais atividades econômicas é a pecuária. A regulamentação mexicana para o controle do gado NOM-ZOO-031-1995 só se concentra no teste de tuberculina para o diagnóstico de M. bovis. Pouco se sabe sobre a presença do NTM no gado da região. Dada a possibilidade de identificação de espécies de actinobactérias pela detecção do marcador molecular do par 100-base no gene 23S rRNA e o sequenciamento subsequente do gene 16S rRNA, é possível identificar as espécies NTM acima mencionadas.

O objetivo do presente estudo foi isolar e identificar espécies NTM de bovinos da região sul do Estado do México. As espécies Mycobacterium foram isoladas de amostras de exsudato nasal e leite bovino e identificadas através da detecção do marcador molecular do par 100-base no gene 23S rRNA com sequenciamento subseqüente do gene 16S rRNA.

2. Materiais e Métodos

2.1. Amostragem

Uma amostragem foi realizada com base na distribuição espacial de rebanhos positivos para tuberculose bovina no estado do México, conduzida por Zaragoza et al. 2015 . Quatro rebanhos de gado foram selecionados na região sul do Estado do México, um rebanho pertencente ao Município de Temascaltepec e três rebanhos pertencentes ao município de Zacazonapan. Um total de 103 amostras, 35 amostras de leite e 68 amostras de exsudato nasal, foram coletadas. A distribuição do número e tipo de amostras coletadas em cada rebanho é mostrada na Tabela 1.

2.2. Obtenção de Amostras de Leite e Exsudado Nasal

O úbere e mamilos foram limpos com água purificada e sabão e depois secos com toalhas de papel, e a assepsia dos mamilos foi subseqüentemente realizada usando esfregaços embebidos em álcool 70%. Cinco mililitros de leite foram coletados diretamente do mamilo em vasos estéreis de 20 mL, descartando o fluxo inicial. O exsudato nasal foi coletado diretamente do interior do orifício nasal com um cotonete estéril de 10 cm de comprimento, que foi então submerso em solução salina isotônica (0,85%). As amostras de leite e exsudato nasal foram armazenadas a 4°C até o processamento.

2,3. Processamento das amostras

2.3.1. Isolamento de Micobactérias

As amostras de leite foram centrifugadas a 2500 rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos. Os pellets das amostras de leite e exsudato nasal foram inoculados no seguinte meio de cultura selecionado para micobactérias: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521), e Middlebrook (BD BBL 254521) suplementado com 6 g de piruvato de sódio por litro (Middlebrook-P). Os meios inoculados foram incubados a 37°C durante 8 semanas e foram avaliados a cada 3 dias.

2.3.2. Classificação das linhagens isoladas

As linhagens isoladas foram distribuídas em grupos de acordo com as seguintes características: pigmentação da colônia, tempo de crescimento e características da colônia (forma, consistência, textura e produção de pigmentos). As cepas isoladas foram coradas com Ziehl-Neelsen para confirmar a presença de bacilos acid-fast (AFB) .

2,4. Extração de DNA

Estirpes com características microscópicas semelhantes às micobactérias (positividade ácido-rápida) e duas cepas representativas de cada grupo foram selecionadas para identificação. Para obter a biomassa, as cepas foram inoculadas em 30 mL de meio de cultura líquido Middlebrook (BD BBL 254521) em frascos de 125 mL e incubadas a 37°C durante 7 dias. O meio líquido foi transferido para tubos Falcon estéreis de 15 mL e centrifugado por 15 minutos a 14.000 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi removido e o granulado foi transferido para tubos Eppendorf de 1,5 mL; os tubos foram então centrifugados a 14.000 rpm × 5 minutos, e o sobrenadante foi descartado. A extração de DNA foi realizada no sedimento resultante usando o kit de purificação de DNA genômico Wizard (Promega A1120).

2,5. Detecção do Marcador Molecular no gene 23S rRNA

O marcador molecular de 100 bp localizado no gene 23S rRNA foi amplificado de acordo com a metodologia descrita por Roller et al. (1992) usando os seguintes primers : 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, e 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

A reação foi conduzida usando uma Taq DNA polimerase comercial (Promega M1661). Foram utilizadas as seguintes condições de ciclo térmico: uma etapa de pré-denatação por 5 minutos (94°C); 29 ciclos de desnaturação por 30 segundos (94°C), hibridação por 45 segundos (46°C), e alongamento por 50 segundos (72°C); e, finalmente, um ciclo de pós-denatação de 5 minutos (72°C). Os fragmentos amplificados foram confirmados em um gel de agarose 2% corado com brometo de etídio (SIGMA 46065).

2,6. Amplificação do 16S rRNA Gene

Estrenos que amplificaram o marcador filogenético de 100 bp foram selecionados para análise do sequenciamento do 16S rRNA. Os seguintes primers foram usados para a amplificação: 8f: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG e 1492r: TACGGGYTACCTTGTTACGACTT.

A reacção foi conduzida utilizando uma Taq DNA polimerase comercial (Promega M1661). Foram utilizadas as seguintes condições de ciclo térmico: uma etapa de pré-denatação por 5 minutos (94°C); 34 ciclos de desnaturação por 30 segundos (94°C), hibridação por 20 segundos (52°C) e alongamento por 1 minuto 30 segundos (72°C); e, finalmente, um ciclo de pós-denatação de 7 minutos (72°C).

Os fragmentos amplificados foram confirmados em um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (SIGMA 46065). Os produtos desta amplificação foram purificados usando o kit Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) e confirmados em um gel de agarose a 1% para verificar sua presença e qualidade.

2,7. Identificação da Espécie Mycobacterium

Os produtos amplificados do gene 16S rRNA foram enviados para o Macrogen Sequencing Service, Maryland, EUA. As sequências obtidas foram analisadas e corrigidas usando o programa BioEdit . As seqüências de consenso foram construídas a partir dos fragmentos para frente e para trás, que foram comparadas com seqüências depositadas anteriormente no GenBank do National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando o programa BLAST e EzTaxon 2.1 .

2.8. Análise Filogenética

Sequências do gene 16S rRNA foram obtidas para as seguintes espécies micobacterianas da American Type Culture Collection (ATCC) e da German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , e M. confluentis . As seqüências das cepas da coleção e das cepas isoladas na presente investigação foram alinhadas com o programa BioEdit . A análise filogenética foi realizada utilizando o método de parcimônia máxima no software MEGA versão 4 . Para formar a raiz do cladograma, foi utilizada a seqüência de Pantoea aglomerans DSM 3493.

3. Resultados

As 108 cepas isoladas das 103 amostras coletadas foram distribuídas em 13 grupos de acordo com suas características morfológicas macroscópicas e microscópicas (Tabela 2). Os grupos 11 e 12, particularmente, foram compostos de cepas ácido-rápido.

Para identificação a nível de espécie, foram escolhidas 39 cepas: 10 delas pertenciam ao grupo 11 e 7 ao grupo 12. Duas linhagens de cada um dos 11 grupos restantes foram selecionadas para completar as 39 linhagens. O marcador molecular de 100 bp foi encontrado nos 33% (13/39) das cepas selecionadas. Para eles, o gene 16S rRNA foi amplificado para seqüenciamento e identificação ao nível da espécie.

A prevalência geral de NTM nas amostras coletadas foi de 12,6% (13/103) considerando tanto amostras de leite quanto de exsudato nasal. Entretanto, a prevalência específica para amostras de exsudato nasal foi de 19,1% (13/68).

De acordo com a comparação de sequências, quatro espécies de NTM do gênero Mycobacterium foram identificadas; 64% (6/13) das cepas tinham 98% e 99% de semelhanças com M. neoaurum, enquanto 31% (4/13) tinham 99% de similaridade com M. parafortuitum, 15% (2/13) tinham semelhanças de 98% e 99% com M. moriokaense, e, finalmente, 8% (1/13) tinham 99% de similaridade com M. confluentis (Tabela 3).

A árvore filogenética foi formada com o gênero Mycobacterium e quatro de suas espécies pelas quais foram observadas as relações filogenéticas entre as cepas de coleta e as cepas isoladas na presente investigação (Figura 1).

Figura 1

Árvore filogenética construída comparando as sequências do gene 16S rRNA das cepas isoladas e de referência.

4. Discussão

As espécies NTM foram isoladas apenas de amostras de exsudato nasal, o que eliminou as amostras de uma das fazendas locais deste estudo (Tabela 1). Verificamos que a prevalência específica foi de 19,1% em rebanhos da região sul do Estado do México. Estudos similares nos Estados Unidos, África do Sul, Tanzânia e Brasil reportaram valores de prevalência de NTM de 3,4%, 24,5%, 7% e 7,8%, respectivamente; portanto, o valor de prevalência encontrado neste estudo está dentro da faixa relatada anteriormente. Neste estudo, 13 das 39 cepas analisadas foram identificadas como as espécies NTM M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis, e M. parafortuitum.

M. neoaurum, um membro do complexo Mycobacterium parafortuitum, é responsável por um amplo espectro de doenças, a maioria delas infecções relacionadas a dispositivos como cateteres Hickman, cateteres BROVIAC, linhas PICC , fístula arteriovenosa que incluiu um enxerto de politetrafluoroetileno, pace makers e endocardite protética da válvula. Pacientes imunocomprometidos com estes dispositivos são os principais hospedeiros, por exemplo, pacientes com câncer e diabéticos com insuficiência renal e problemas cardíacos . O M. neoaurum também foi isolado de pacientes com infecções urinárias, meningoencefalite e alterações do sistema nervoso central, bacteremia e endocardite, e infecção pulmonar. Embora tenha sido isolado principalmente de casos clínicos, há também relatos de seu isolamento do leite e do gado .

M. moriokaense foi isolado da amostra de expectoração . Embora seja considerado não patogênico para humanos, tem sido associado a doenças pulmonares . M. confluentis também foi isolado de amostras de escarro, e, juntamente com M. parafortuitum, ambos são considerados espécies não patogênicas. M. confluentis, M. moriokaense, e M. neoaurum foram isolados de diferentes tecidos bovinos e de animais selvagens com lesões tuberculosas, enquanto o M. parafortuitum foi isolado apenas de leite bovino . Entretanto, em nosso trabalho, o M. parafortuitum foi isolado apenas de amostras de exsudato nasal.

As necessidades nutricionais das micobactérias diferem entre várias espécies, o que foi a razão para o uso de diferentes meios de cultura. Notavelmente, sete das 13 cepas identificadas neste estudo foram isoladas em meio Stonebrink, incluindo M. neoaurum, M. parafortuitum, e M. moriokaense. Este resultado é consistente com o descrito por Sepúlveda et al. que indicaram que o meio Stonebrink é adequado para a recuperação de diferentes espécies do gênero Mycobacterium. García-Martos e García-Agudo relataram que o meio Middlebrook é ótimo para o isolamento de actinomycetes, o que está de acordo com a presente investigação, considerando que duas espécies, M. neoaurum e M. parafortuitum, foram isoladas neste meio. Notavelmente, M. confluentis foi isolado apenas no meio Middlebrook suplementado com piruvato de sódio; assim, a estratégia de usar diferentes meios de cultura foi apropriada porque permitiu o isolamento de diferentes espécies do gênero Mycobacterium.

A detecção do marcador molecular presente no gene 23S rRNA da bactéria Gram-positiva com conteúdo de HGC permitiu a discriminação entre estirpes de eubactérias e micobactérias. A análise sequencial do gene 16S rRNA tornou possível a identificação ao nível da espécie; portanto, a combinação destas metodologias é apropriada para a identificação de espécies NTM.

5. Conclusões

Usando a metodologia descrita neste estudo, quatro espécies de NTM foram isoladas e identificadas: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum, e M. parafortuitum. Estas espécies foram isoladas pela primeira vez a partir de exsudados nasais de bovinos da região sul do Estado do México. Três das espécies identificadas (M. neoaurum, M. moriokaense e M. confluentis) são de importância veterinária e de saúde pública.

Divulgação

Este trabalho é derivado da tese de doutorado em Ciências da Saúde (Universidad Autónoma del Estado de México), registrada no PNPC-CONACYT.

Conflitos de interesse

Todos os autores declaram não ter nenhum conflito de interesse.

Conhecimentos

Os autores gostariam de agradecer a assistência financeira da Secretaria de Pesquisa e Estudos Avançados da Universidade Autônoma do Estado do México (UAEMex) através das seguintes bolsas de pesquisa: (i) “Implementação de Sistemas e Técnicas de Informação Geográfica de Biologia Molecular, como ferramentas na detecção e identificação de Mycobacterium spp.”, SIEA-UAEM 3486/2013CHT, e (ii) a rede “Microbiología y química en las Ciencias de la Salud”, 039/2014RIF.