Allios trp53 nulos e R270H mutantes têm efeitos comparáveis na regulação da invasão, metástase e expressão gênica na tumorigenese do cólon de camundongo

Missenso e mutações trp53 nulas promovem a progressão tumoral do cólon de camundongo no CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Ratos Kras LSL-G12D (AK)

Para desenvolver um modelo de tumor no cólon de camundongo instigado por defeitos genéticos como aqueles frequentemente presentes em tumores de cólon humanos, geramos ratos mutantes compostos carregando um alelo Apcflox flutuante (Apcflox, 580S, abreviado como A) que poderia ser inativado pela função de recombinação Cre e um alelo de Kras (KrasLSL-G12D, abreviado como K) latentemente oncogênico e flutuado que poderia ser ativado pela recombinação Cre. Usando o transgene CDX2P-CreERT2 e o tratamento TAM para ativar a função Cre em células epiteliais de cólon, nós objetivamos os alelos Apc e Kras em epitélio do íleo distal, ceco e cólon. Enquanto os ratos CDX2P-CreERT2 K mostram epitélio serrilhado e hiperplásico do cólon, os ratos CDX2P-CreERT2AK (AK) tinham epitélio serrilhado e hiperplásico do cólon e também desenvolveram uma média de 13 adenomas com tamanho variando de 0,5 mm a 2 mm até o momento em que os pontos finais humanos foram alcançados para os ratos aos 10-15 meses após o tratamento com TAM (Fig. 1a). Em seis dos 10 ratos AK, encontramos um ou dois adenocarcinomas surgindo no ceco. Dos oito adenocarcinomas totais encontrados nos 10 ratos AK estudados, sete tumores invadiram a musculatura propria (MP) ou mais profunda e cinco alcançaram a sub-serosa ou serosa (Fig. 1b, Tabela 1 e Tabela Complementar 1). Entretanto, como apenas 8 dos 131 tumores observados nos camundongos AK eram invasivos, os achados implicam que defeitos somáticos adicionais além das mutações Apc e Kras foram necessários para o desenvolvimento de tumores invasivos do cólon nos camundongos AK.

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Missenso e nulo Trp53 mutações promovem a progressão do tumor no cólon de camundongos em ratos CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Kaplan-Meier curvas de sobrevivência de ratos CDX2P-CreERT2AK (AK) (n = 10, mediana de sobrevivência = 336 dias), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) (n = 16, mediana de sobrevivência = 166 dias), Ratos CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) (n = 16, mediana de sobrevivência = 97 dias) e ratos CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) (n = 20, mediana de sobrevivência = 88 dias). O TAM foi administrado diariamente durante dois dias e o tempo zero representa o segundo desses dias. Os valores de P foram obtidos pelo teste de log-rank nas seguintes comparações: P = 1.4E-6 para AK vs. AKP270/+; P = 1.4E-7 para AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1.9E-8 para AKP270/fl vs. AKP270/+. b Percentagem de tumores no cólon com diferentes profundidades de invasão de ratos AK, ratos AKP270/+, ratos AKPfl/fl e ratos AKP270/fl. Os dados são de lesões múltiplas por rato (n = 10-14 ratos por grupo). Os valores de P baseados nos testes Fisher Exact e Exact Poisson são mostrados na Tabela 1 e na Tabela Suplementar 1, respectivamente. As barras de erro são erros padrão da média. A adenoma, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Hematoxilina e eosina (H&E) coloração de tumores invasivos representativos de tecidos do cólon proximal (direita) e ceco (esquerda) são mostrados para AKP270/fl ratos (c) e AKPfl/fl ratos (d). Os tumores em (c) e (d) foram coletados 3 meses após a injeção de TAM. Imagens com alta ampliação são mostradas nos painéis inferiores e são encaixotadas nas áreas de ampliação inferior nos painéis superiores correspondentes. As linhas tracejadas indicam o limite entre a camada muscular e a subserosa. Barras de escalas: 500 μm para imagem com baixa ampliação (painéis superiores); 100 μm para imagens de alta ampliação (painéis inferiores)

Como foi observado acima, as mutações TP53 são encontradas em cerca de 60% dos CRCs humanos e parecem ser selecionadas para durante a progressão do adenoma. Procuramos avaliar a cooperação da inativação do Trp53 com as mutações Apc e Kras na progressão in vivo do tumor do cólon, bem como determinar se os potenciais efeitos GOF de um alelo mutante falso Trp53 poderiam ser vistos no modelo. Introduzimos um alelo constitutivo Trp53R270H mutante (o equivalente murino do R273H humano, referido como P270) e/ou um alelo nulo condicional Trp53flox (referido como Pfl) no modelo AK. Foram gerados ratos com genótipos compostos e as suas abreviaturas são as seguintes: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (ratos AKP270/+), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (ratos AKP270/fl) e CDX2P-CreERT2AKPfl/fl(ratos AKPfl/fl). Coortes de ratos adultos AKP270/+, AKP270/fl, e AKPfl/fl foram induzidos para tumores no cólon através do tratamento TAM e o seu estado de saúde foi monitorizado. Em comparação com os ratos AK (mediana de sobrevivência = 336 dias), os ratos AKP270/+, AKP270/fl, AKPfl/fl tinham todos uma esperança de vida significativamente mais curta. Os camundongos AKP270/fl e AKPfl/fl tinham mediana de sobrevivência de 88 e 97 dias, respectivamente, e os camundongos AKP270/+ tinham mediana de sobrevivência de 166 dias (Fig. 1a). Os camundongos AKP270/+ tiveram sobrevida significativamente mais longa que os camundongos AKP270/fl e AKPfl/fl (P < 0,0001 para cada um comparado com os camundongos AKP270/+), mas nenhuma diferença estatisticamente significativa foi observada quando comparados os camundongos AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 1a). A adição da(s) mutação(ões) Trp53 (R270H ou nula) aumentou significativamente a incidência total do tumor em relação ao observado em camundongos AK (P < 0,0001 para ambos AKPfl/fl e AKP270/fl, quando comparado com camundongos AK, Tabela Suplementar 1 inferior esquerda). Os camundongos AKP também tinham múltiplos tumores no cólon e ceco que manifestavam características invasivas (7,3 e 8,9 tumores invasivos por camundongo para camundongos AKPfl/fl e AKP270/fl, respectivamente) em comparação com os camundongos AK (0,8 tumores invasivos por camundongo; Fig. 1b e Tabela Suplementar 1 superior direita, P < 0,0001 para ambos AKPfl/fl vs. AKPfl/fl, respectivamente). AK e AKP270/fl vs. comparações AK).

Análise em profundidade do ceco do rato e tecidos do cólon obtidos na necropsia definiu a extensa carga tumoral nos ratos AKP270/+, AKPfl/fl e AKP270/fl, com lesões variando de adenomas a adenocarcinomas em estágio tardio (Fig. 1b-d e Tabela 1). Todos os camundongos AKP270/+, AKPfl/fl e AKP270/fl estudados tinham pelo menos um adenocarcinoma (tumores com invasão submucosa ou profunda). Evidência de invasão em músculo liso e, em alguns casos, à serosa foi encontrada tanto na região do ceco como na região proximal do cólon dos ratos AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 1c, d, respectivamente). Os camundongos AKP270/+, onde as células epiteliais Cre-target inicialmente retêm um alelo Trp53 tipo selvagem funcional, tiveram um período de latência mais longo para o desenvolvimento tumoral e a carga tumoral total (18,5 por camundongo) e as porcentagens de tumores com invasão mais profunda (11.9%) foram significativamente menores quando comparados com AKP270/fl ou AKPfl/fl ratos (Tabela Suplementar 1 e Tabela 1, P < 0,01 comparados com AKP270/fl ou AKPfl/fl ratos para carga tumoral por camundongo e as porcentagens de adenocarcinomas). Estes achados suportam a noção de que o tipo selvagem p53 tem uma função supressora tumoral na tumorigenese do cólon, mesmo no contexto de um alelo mutante falso Trp53. Quando todos os tumores observados foram comparados entre ratos AKP270/fl e AKPfl/fl, encontramos que a proporção de adenocarcinomas com invasão submucosa ou mais profunda foi maior em ratos AKP270/fl do que em ratos AKPfl/fl (36,9% e 26,1% para AKP270/fl e AKPfl/fl, respectivamente; Tabela 1, P = 0,0026), sugerindo um possível modesto efeito GOF para o alelo R270H Trp53 no aumento da invasão tecidual. Entretanto, o modesto aumento do potencial invasivo em camundongos AKP270/fl pode ser compensado, porque a carga tumoral média por camundongo tende a ser maior em camundongos AKPfl/fl do que em camundongos AKP270/fl (28,0 vs 24,2 por camundongo, P = 0.054; Tabela suplementar 1), e os camundongos AKPfl/fl e AKP270/fl não apresentaram diferenças significativas na incidência de adenocarcinomas (7,3 vs 8,9 adenocarcinomas por camundongo, Tabela suplementar 1 superior direita, P = 0,16). Além disso, a invasão de alguns tumores em musculopropria, subserosa ou serosa foi observada tanto em camundongos AKP270/fl quanto em camundongos AKPfl/fl (Fig. 1b e Tabela 1). Como apenas cerca de 30% dos tumores de ratos AKP270/fl ou AKPfl/fl progrediram para adenocarcinomas durante o período de estudo, alterações somáticas adicionais além de defeitos Apc, Kras e Trp53 são provavelmente críticas na geração de carcinomas nos ratos AKP.

Histologia tumoral e metástase em camundongos AKP270/fl ou AKPfl/fl

Cada camundongo AKP270/fl e AKPfl/fl desenvolveu um ou mais adenocarcinomas até o momento em que os pontos finais humanos foram alcançados. Em camundongos AKP270/fl, mais de 80% dos adenocarcinomas apresentaram características moderadamente diferenciadas, com brotação/rotação de tumor na frente de invasão e secreção ocasional de mucina (Fig. 2a, topo). Cerca de 15-20% dos adenocarcinomas AKP270/fl foram pouco diferenciados, com morfologia sólida tipo trabecular (Fig. 2a, meio). Raros carcinomas de células signet-ring foram observados em ratos AKP270/fl (Fig. 2a, inferior). Em camundongos AKPfl/fl, cerca de 50% dos adenocarcinomas foram bem a moderadamente diferenciados com secreção de mucina (Fig. 2b, superior); os demais foram pouco diferenciados (Fig. 2b, inferior). Forte coloração nuclear e citoplasmática de β-catenin foi observada em tumores invasivos AKP270/fl e AKPfl/fl (Fig. 2, meio), consistente com sinalização de Wnt defeituosa decorrente da inativação de Apc. Forte coloração nuclear para p53 foi observada nas células tumorais AKP270/fl. Como esperado, nenhuma coloração para p53 foi observada nas células tumorais AKPfl/fl (Fig. 2, direita).

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Tipos histológicos de adenocarcinomas de cólon de ratos mutantes p53. H&E corantes (painéis esquerdos) e imunohistoquímicos para β-catenin (painéis médios) e p53 (painéis direitos) são mostrados para tumores independentes do cólon de tipos histológicos representativos dos ratos AKP270/fl (a) e AKPfl/fl (b). Os tumores foram coletados 3 meses após a indução do TAM. Barras de escamas: 50 μm

Na necropsia, foram encontradas metástases linfonodais em 3 de 13 ratos AKPfl/fl e 5 de 14 ratos AKP270/fl (Tabela 2). Dentre os três ratos AKPfl/fl que cada um tinha uma metástase a um gânglio linfático abdominal, um rato também tinha múltiplas metástases no pulmão e outro rato tinha múltiplas metástases no fígado (Tabela 2). Entre os cinco ratos AKP270/fl, cada um com uma metástase a um gânglio linfático abdominal, um rato tinha múltiplas metástases no pulmão e outro tinha lesões metastáticas tanto no pulmão como no fígado (Tabela 2). Não foram encontradas lesões metastáticas em camundongos AK ou AKP270/+ (Tabela 2). Nossos dados indicam que os CRCs de camundongos com mutações errôneas ou nulas no Trp53 podem dar origem a linfonodos espontâneos e metástases distantes em freqüências comparáveis, argumentando contra um efeito GOF para as mutações do Trp53 de missense em melhorar as metástases em nosso modelo de CRC de camundongos.

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Transição epitelial-mesquimal em CRCs metastáticos com missense ou nulo Trp53

Nos depósitos linfonodais metastáticos individuais encontrados em cada um dos cinco diferentes camundongos AKP270/fl, Quatro lesões mostraram adenocarcinoma moderadamente diferenciado e uma lesão foi pouco diferenciada (Fig. 3a, b, painéis superiores). Todas as lesões metastáticas linfonodais moderadamente diferenciadas tinham forte coloração nuclear β-catenin, bem como forte coloração de membrana para E-cadherina e ausência de coloração de vimentina (Fig. 3a), sugerindo retenção de propriedades epiteliais em células metastáticas AKP270/fl que retiveram características moderadamente diferenciadas. No único rato AKP270/fl onde a metástase linfonodal tinha características pouco diferenciadas, lesões adenocarcinoma com morfologia pouco diferenciada também foram encontradas no pulmão, fígado e ceco (Fig. 3b e Suplemento Fig. 1). A lesão cecunar pouco diferenciada e as lesões metastáticas mostraram forte coloração nuclear β-catenina e perda de expressão de E-cadherina e forte expressão de vimentina, consistente com as características de transição epitelial-mesenchimal (TME) (Fig. 3b e Suplemento Fig. 1). Todas as lesões metastáticas em ratos AKP270/fl coradas positivamente para CDX2 (Suplemento Fig. 2), consistentes com sua origem epitelial cólica.

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Tumores metastáticos derivados de cólon com mutações Trp53 missense podem sofrer transição epitelial-mesquimal (TME). Fotomicrografias de H&Seções manchadas de H&E mostrando os gânglios linfáticos e metástases pulmonares encontrados em dois ratos representativos AKP270/fl (a, b, painéis superiores). Manchas imunohistoquímicas mostrando forte expressão nuclear de β-catenin, forte expressão de membrana de E-cadherin e ausência de expressão de vimentina para as lesões moderadamente diferenciadas encontradas em um rato representativo (a, três painéis inferiores). Em contraste, as lesões pouco diferenciadas encontradas em outro rato (b) mostram forte expressão nuclear de β-catenin, perda de expressão de E-cadherin e forte expressão de vimentina, indicando que as lesões metastáticas encontradas neste rato foram submetidas a EMT (b, três painéis inferiores). As fotomicrografias representativas dos cortes de H&E foram mostradas com baixa ampliação de potência para orientação; os cortes em série foram submetidos à coloração imunohistoquímica e a área da caixa com manchas para β-catenin, E-cadherin e vimentin foram mostradas como alta ampliação de potência. Barras de escala: 20 μm para todas as imagens

Duas das três metástases linfonodais de ratos AKPfl/fl portadores de tumor foram moderadamente diferenciadas e uma foi pouco diferenciada (Fig. 4a, b, painéis superiores). O rato AKPfl/fl com metástase hepática tinha uma metástase linfonodal moderadamente diferenciada. Neste rato com metástase hepática, o presumível adenocarcinoma primário do cólon índice, bem como o linfonodo e as lesões metastáticas hepáticas mostraram uma forte expressão nuclear de β-catenin e uma forte expressão da membrana de E-cadherina (Fig. 3 Suplementar). No rato AKPfl/fl simples com uma metástase linfonodal pouco diferenciada, lesões múltiplas com morfologia semelhante também foram encontradas em seu pulmão (Fig. 4b). Estudos imunohistoquímicos mostraram que as lesões metastáticas pulmonares e o presumível adenocarcinoma primário de índice no ceco tiveram forte expressão nuclear de β-catenina e expressão reduzida de E-cadherina e forte expressão de vimentina, consistente com o EMT no câncer primário e células metastáticas (Fig. 4b). As lesões metastáticas em camundongos AKPfl/fl eram todas CDX2-positivas (Suplemento Fig. 4). Em conjunto, nossos dados indicam que não há diferença significativa nas características histológicas das lesões metastáticas que surgem em ratos AKP270/fl ou AKPfl/fl, e o subconjunto pouco diferenciado dos tumores primários e das lesões metastáticas com mutações Trp53 missense ou nulas pode manifestar características EMT.

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Tumores metastáticos derivados de cólon com mutações Trp53 nulas podem sofrer transição epitelial-mesenchimal (TME). uma Fotomicrografia de uma secção de H&E mostrando uma lesão tumoral moderadamente diferenciada encontrada no gânglio linfático de um rato AKPfl/fl representativo 2,5 meses após a injecção de TAM (painel superior). Manchas imunohistoquímicas para esta lesão mostram forte expressão nuclear de β-catenin, forte expressão da membrana de E-cadherin e ausência de expressão de vimentina (três painéis inferiores). b Fotomicrografias de cortes de H&E-manchados mostrando as lesões pouco diferenciadas encontradas no ceco, linfonodo e pulmão de outro camundongo AKPfl/fl 4 meses após a injeção de TAM (painel superior). Todas estas lesões mostram forte expressão nuclear de β-catenin, perda de expressão de E-cadherin e forte expressão de vimentina, indicando que as lesões primárias e metastáticas encontradas neste camundongo foram submetidas a TAM (painel inferior três painéis). As fotomicrografias representativas dos cortes de H&E foram mostradas com baixa ampliação de potência para orientação; os cortes em série foram submetidos à coloração imunohistoquímica e a área da caixa com manchas para β-catenin, E-cadherin e vimentin foram mostradas como alta ampliação de potência. Barras de escamas: 20 μm para todas as imagens

Estabilização da proteína p53 mutante missense está associada com perda da proteína p53 do tipo selvagem e progressão da doença

A maioria dos tumores humanos com mutações TP53 missense foram relatados para mostrar perda da heterozigosidade TP53 (LOH) , e um estudo indicou que o TP53 LOH é um pré-requisito para a estabilização do p53 mutante missense tanto em sarcomas de camundongos quanto em carcinomas de mama . Avaliamos padrões de coloração do p53 em vários estágios de desenvolvimento tumoral em camundongos AKP270/+ após indução de tumorigenese por injeção de TAM, pois o epitélio do cólon Cre-target em camundongos AKP270/+ tem inicialmente um alelo Trp53 funcional. Em pólipos hiperplásicos em camundongos AKP270/+, onde Kras é ativado e Apc LOH ainda não havia ocorrido, a coloração do p53 é indetectável (Fig. 5b, painel HP), semelhante à coloração negativa para p53 vista no epitélio de camundongos do tipo selvagem (Fig. 5a), embora a proteína mutante falsa p53 R270H seja constitucionalmente expressa nos tecidos do cólon dos camundongos AKP270/+. Alguns p53 imunoreatividade foi claramente observada em adenomas (Fig. 5b, painel adenoma e Tabela 3, n = 185) e carcinomas (Fig. 5c e Tabela 3, n = 28) surgindo em camundongos AKP270/+. Dentre esses tumores, 94% dos adenomas e 43% dos carcinomas apresentaram fraca coloração p53 (Fig. 5 e Tabela 3, 5-10% de positividade), enquanto 6% dos adenomas e 57% dos carcinomas apresentaram forte coloração p53 (Fig. 5 e Tabela 3, >10% de positividade, P < 0,0001). A maioria dos tumores com coloração forte de p53 mostrou p53 LOH, enquanto os tumores com coloração fraca de p53 ainda retiveram o alelo tipo selvagem Trp53 (Fig. 6). Nossos resultados são semelhantes aos encontrados em trabalhos recentes sobre a expressão da falta de expressão da proteína p53 em sarcomas de camundongos e carcinoma de mama. Nossos dados demonstram que, assim como a situação na tumorigenese do cólon humano, a expressão de uma proteína p53 mutante de falta de sentido estabilizada está intimamente correlacionada com a perda da função do tipo selvagem p53 e a progressão para a invasão.

A estabilização da proteína mutante p53R270H durante a progressão tumoral de hiperplasia para carcinoma em camundongos AKP270/+. Coloração imunohistoquímica da p53 em um pólipo hiperplástico representativo (HP, b, painel esquerdo), um adenoma (b, painel direito) e três carcinomas (c) surgindo no ceco de camundongos AKP270/+. Uma seção do ceco de um rato do tipo selvagem foi usada como controle (a). A coloração p53 varia de coloração não detectável nas secções normal (a) e HP (b), a coloração fraca (<10% de positividade) no adenoma (b) e carcinoma 1(c, painel esquerdo), e a coloração forte nos carcinomas 2 e 3 (>10% de positividade). As linhas tracejadas indicam as mucosas musculares. Setas pretas indicam as glândulas invasivas com coloração p53 fraca; setas vermelhas indicam a glândula invasiva com coloração p53 forte. As barras de escala: 50 μm

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A estabilização do mutante falso p53R270H está correlacionada com a perda de heterozigosidade (LOH) do p53. a Genotipagem de tumores de cólon (T2-T6) surgindo em ratos AKP270/+ 5 meses após a indução do TAM. Um tumor que surge em um rato AKP270/fl (T1) e tecido do cólon de um rato selvagem (N) são usados como controle positivo e negativo, respectivamente. A presença do alelo do tipo selvagem Trp53 e do alelo mutante recombinado Trp53 (flox out) foram detectados por PCR. b-e A coloração imunohistoquímica do p53 nos tecidos do cólon descrita em (a) mostra uma forte correlação entre a estabilização do p53 mutante (d, T2 e T3) e a perda de heterozigosidade do p53, em comparação com a coloração fraca do p53 e a presença do alelo selvagem do Trp53 nos tumores 4-6 (e). As linhas tracejadas indicam as mucosas musculares. Barras de escamas: 100 μm

O perfil de expressão do gene global revela poucas diferenças entre as células tumorais do cólon de camundongos ou humanos que abrigam células tumorais do cólon R270H/R273H mutantes de falta e alelos nulos do Trp53/TP53

Perfisamos a expressão do gene nos tecidos do adenocarcinoma do cólon de camundongos AKP270/fl (n = 6) ou AKPfl/fl (n = 6), usando camundongos Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays com 24.562 conjuntos de sondas. Isolamos RNA após microdissecção de captura a laser (LCM) de células cancerosas a partir de um tumor primário invasivo de cada rato. Como controles, foram incluídas microdissecções de células epiteliais normais do cólon de ratos do tipo selvagem (n = 3). Nós ajustamos modelos de ANOVA a estas 15 amostras com termos para 3 meios. Comparações dos tecidos tumorais com tecidos normais deram mais de 2400 conjuntos de sondas com P < 0,001 para ambos os tumores AKP270/fl e AKPfl/fl, mas a comparação dos dois tipos de tumor um com o outro deu apenas 30 conjuntos de sondas, onde esperamos 24,6 conjuntos de sondas (24.562*0,001) meramente por acaso. Este último resultado indica que a maioria dos 30 conjuntos de sondas encontradas são falsos positivos (Tabela 4, porção superior), e houve poucas ou nenhumas diferenças significativas observáveis na expressão gênica entre tumores de cólon com mutações de falta Trp53 e aqueles com mutações nulas de Trp53. Consistentes com esta noção, encontramos os adenocarcinomas AKP270/fl e AKPfl/fl indistinguíveis na análise do componente principal (PC) da expressão gênica, embora ambos os grupos de tumores tenham padrões de expressão gênica claramente distintos do epitélio do cólon do tipo selvagem (Fig. Complementar. 5).

Afetizamos também a análise da expressão gênica Affymetrix em organóides derivados de tumores do cólon que surgem em camundongos AKP270/fl (n = 3) ou AKPfl/fl (n = 2). Organóides derivados de adenomas em ratos Apcfl/fl (Cont 1, n = 3) ou de epitélio do cólon do tipo selvagem (Cont 2, n = 4) foram usados como controles. Nós ajustamos um modelo de ANOVA aos quatro grupos de organóides. Encontramos 435 conjuntos de sondas com P < 0,001 para organóides AKPfl/fl e 609 conjuntos de sondas para organóides AKP270/fl, quando comparados com organóides Apc-null (Cont 1, Tabela 4). Além disso, foram identificados conjuntos de sondas expressas de forma mais diferenciada (960 para AKPfl/fl e 1332 para AKP270/fl, P < 0,001) quando AKPfl/fl ou AKP270/fl organóides foram comparados com organóides normais do cólon (Cont2, Tabela 4). Realizamos o teste de enriquecimento do caminho em genes que foram diferentemente expressos em tumores AKPfl/fl e AKP270/fl e organóides comparados com o epitélio normal do cólon. Verificamos que uma variedade de caminhos foi significativamente alterada tanto nas células p53 nulas quanto nas células mutantes derivadas de tumores, com genes envolvidos no ponto de checagem G2M, crescimento celular, resposta ao estresse e metabolismo celular como os conjuntos de genes mais significativamente alterados (Tabela Complementar 2). Entretanto, obtivemos apenas 35 conjuntos de sondas com P < 0,001 para comparação AKPfl/fl vs. AKP270/fl (Tabela 4), onde novamente 24,6 eram esperados por acaso, mostrando que era difícil encontrar diferenças de expressão gênica entre os organóides com mutações Trp53 nulas e missensas. Os gráficos de PC mostraram amostras AKPfl/fl e AKP270/fl sempre agrupadas, e foram separadas dos organóides derivados de adenomas Apc-mutant (Cont1, Suplemento Fig. 6) ou epitélio normal do cólon (Cont2, Suplemento Fig. 6).

Para testar se existiam diferenças demonstráveis nos padrões de expressão gênica entre CRCs humanos com missense e mutações TP53 nulas, analisamos contagens normalizadas log2-transformadas a partir de dados RNA-seq para CRCs no The Cancer Genome Atlas (TCGA) , comparando 9 tumores com o códon TP53 273 de mutações de falta com 36 tumores com mutações nulas (causadas por mudança de estrutura, local de emenda e mutações sem sentido, veja a Tabela Suplementar 3 para detalhes) pelo teste T de duas amostras para 20531 genes. Encontramos apenas 244 genes com P < 0,01 e 30 genes com P < 0,001, que foram apenas ligeiramente mais que o número esperado por acaso (205 e 20,5, respectivamente, Tabela 4). O próprio TP53 deu a diferença mais significativa na expressão gênica, sendo quase 5 vezes menor, em média, em tumores com mutações nulas vs. TP53 códon 273 mutações (Tabela Suplementar 4, P = 2 × 10-10). Novamente, encontramos pouca separação dos dois conjuntos de tumores na análise do PC (Fig. 7 do Suplemento). Consistente com a assinatura transcripcional semelhante, ajustamos os modelos de risco proporcional Cox a 43 pacientes com dados de sobrevivência, usando idade, estágio e estado TP53 no modelo, e não encontramos nenhuma associação significativa entre o resultado do paciente e o estado de mutação TP53 (mutação de falta R273 vs. mutação nula, Tabela Complementar 5, P = 0,67 pelo teste de Wald). Vale ressaltar que com apenas 7 mortes entre esses pacientes, o poder de detecção de diferenças foi bastante baixo. Finalmente, observamos a intersecção dos genes dando P < 0,05 em qualquer um dos três conjuntos de dados descritos acima (ou seja, tumores no cólon humano e de camundongos, organóides do cólon de camundongos) que mudaram na mesma direção para a falsa mutação Trp53/TP53 vs. comparação nula. Na Tabela Suplementar 4 mostramos genes que deram P < 0,05 e alterações dobráveis de pelo menos 1,3 em qualquer um dos três conjuntos de dados. Encontramos apenas Trp53/TP53 que mudou na mesma direção nos três estudos (Tabela Suplementar 4; as estatísticas detalhadas para cada gene em todos os três conjuntos de dados estão disponíveis em nossas séries públicas GEO). Em conjunto, nossas análises de expressão gênica para CRCs de camundongos e humanos indicam que tumores de cólon com missense R270/R273 ou mutações nulas do Trp53/TP53 têm perfis de expressão gênica muito similares, o que é consistente com a ausência de grandes diferenças nas características biológicas dos tumores de cólon e fenótipos que surgem in vivo nos ratos AKP270/fl e AKPfl/fl.