A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot

By Sarah Moore, M.Sc.Reviewed by Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistochemistry and Western blotting both work by exploiting the principle of how antibodies specifically bind to the antigens present in biological tissue.

Image Credit: Sinitar/.com

Immunohistochemistry is the most common of immunostaining techniques. Ela visualiza a presença de antígenos alvo dentro de uma amostra de tecido usando anticorpos que se ligam aos antígenos, tendo um efeito catalítico, e dividindo a molécula em compostos identificáveis. A visualização desta interação pode ser obtida usando uma enzima (produzindo um sinal cromogênico) ou um fluoróforo (criando um sinal fluorescente).

Western blot funciona com o mesmo princípio. Foi relatado pela primeira vez nos anos 70 quando os cientistas o utilizaram pela primeira vez para classificar com sucesso as diferentes proteínas existentes no tecido biológico da proteína. Desde então, avanços significativos na tecnologia têm sido feitos, levando ao estabelecimento da moderna técnica Western blot fluorescente, colorimétrica e quimioluminescente.

Todas as versões do método Western blot dependem do funcionamento do complexo antígeno-anticorpo para identificar proteínas específicas presentes em uma amostra, indicadas ou pelas reações enzimático-substrato de moléculas colorimétricas, quimioluminescentes, ou fluorescentes. A luz produzida por estas fontes pode ser utilizada para inferir a presença e concentração das proteínas numa amostra.

Comparando as técnicas

Embora os dois métodos se baseiem no princípio da interação anticorpo-antigénio, existem algumas grandes diferenças entre as duas técnicas. Abaixo, decompõe-se isto, passo a passo.

Primeiro, para ambas as técnicas, a amostra deve ser preparada correctamente. A preparação difere bastante entre as duas técnicas. Para imunohistoquímica, as amostras de tecido são fatiadas ou deixadas inteiras, dependendo do seu tamanho.

O limite para o tamanho das amostras geralmente varia de 3 µm a 5 µm. Em seguida, as amostras são incorporadas num meio, geralmente cera de parafina ou criomídia. Em seguida, as fatias são colocadas em lâminas e desidratadas usando resistências crescentes de lavagens com álcool, finalmente, terminando com a adição de um detergente para limpar a amostra, deixando-a pronta para ser vista ao microscópio.

Por outro lado, Western blot requer que as amostras sejam primeiro separadas por eletroforese e depois imobilizadas em uma membrana blotting.

O método de coloração da amostra também é ligeiramente diferente entre as duas técnicas. A imunohistoquímica adiciona anticorpos policlonais ou monoclonais. Estes anticorpos são classificados como reagentes primários ou secundários, sendo os primeiros reagentes levantados contra um antigénio alvo e são normalmente não conjugados, sendo o último conjugado com uma molécula de ligação que depois recruta moléculas repórteres.

A versão conjugada é usada em um método de coloração direta, onde o anticorpo reage diretamente com o antígeno na amostra, a versão não conjugada é usada em um método de coloração indireta onde o anticorpo não marcado se liga ao antígeno alvo dentro do tecido, fazendo com que um anticorpo secundário reaja com o anticorpo primário.

Em comparação, o método Western blot vê um corante fluorescente adicionado à amostra, seguido pela exposição a uma fonte de luz do comprimento de onda apropriado para excitar as moléculas dos fluoróforos.

Após algum tempo, os fluoróforos excitados eventualmente liberam a energia que eles ganharam da fonte de luz para retornar ao seu estado de solo. Esta libertação de energia é o que faz os fluoróforos fluorescerem, emitindo uma fonte de luz que pode ser capturada por um gerador de imagens digital.

Comparando os benefícios e desvantagens

A principal vantagem da imunohistoquímica é que o método permite aos investigadores detectar a localização exacta de uma proteína alvo dentro de uma amostra de tecido. Esta principal vantagem levou a que ele se tornasse bem estabelecido dentro do campo da neurociência como um método robusto para investigar a expressão da proteína em locais-alvo do cérebro.

Por outro lado, o método tem uma grande desvantagem quando comparado com o método Western blot. Isto é o fato de que as manchas não são verificadas contra uma escada de peso molecular, pois estão em Western blot, o que significa que não há como provar que a coloração mostrada na imunohistoquímica está conclusivamente relacionada a uma proteína específica.

O método indireto da imunohistoquímica é reconhecido por ser altamente sensível, entretanto, o método direto é conhecido por ser o oposto, e é geralmente incapaz de detectar pequenas concentrações de antígenos alvo.

O método Western blot é vantajoso, pois se estabeleceu como uma técnica confiável para a coleta de dados quantitativos. Contudo, a sua vantagem mais proeminente é que provou ser eficaz na geração de um sinal proporcional à quantidade de proteína existente na amostra.

Além disso, o Western blot é frequentemente escolhido pela sua capacidade de detectar numerosas proteínas alvo simultaneamente, tendo o efeito de reduzir significativamente o tempo de teste, bem como reduzir o número de recursos necessários.

Uma diferença nas aplicações

Existe uma grande sobreposição nas aplicações das duas técnicas, dado que são tão semelhantes. No entanto, em geral, a imuno-histoquímica é mais utilizada como ferramenta de diagnóstico para numerosos cancros.

O método é utilizado para identificar células anormais que são características de certos tumores. O método é também amplamente utilizado para identificar e localizar proteínas e biomarcadores encontrados tanto em tecidos normais como doentes. Finalmente, também é comumente usado para detectar numerosos organismos infecciosos nos tecidos.

Em comparação, o Western blot é usado principalmente para a detecção de doenças auto-imunes, alergias, e doenças infecciosas. É amplamente utilizada nos campos da biologia molecular, bioquímica e biologia celular, sendo as suas aplicações mais notáveis utilizadas como ferramenta de diagnóstico do HIV e da BSE.

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Escrito por

Sarah Moore

Depois de estudar Psicologia e depois Neurociência, Sarah rapidamente encontrou o seu prazer em pesquisar e escrever trabalhos de pesquisa; voltando-se para uma paixão de conectar idéias com as pessoas através da escrita.

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