Ácido gordo sintase humana: Estrutura e seletividade do substrato do domínio tioesterase

Os três resíduos catalíticos dos ETs FAS humanos (Ser-2308, His-2481, e Asp-2338) estão ligados um ao outro e aos resíduos vizinhos por uma extensa rede de ligação de hidrogênio (Fig. 4). O grupo hidroxila do Ser-2308 está envolvido em uma ligação cooperativa de hidrogênio, aceitando da espinha dorsal amida adjacente do Tyr-2309 e doando para Nε2 do His-2481. Isso, por sua vez, facilitaria a ativação do Ser-2308 como nucleófilo e ajudaria a estabilizar o intermediário tetraédrico de oxianião que se espera formar durante a reação catalítica do ET, como visto nas hidrolases serinas. O resíduo His-2481 (Nε2), por sua vez, é ligado a hidrogênio ao Asp-2338 (Oδ2). O Asp-2338 (Oδ1 atom) faz ligações adicionais de hidrogênio com a amida da espinha dorsal do Ala-2448 e o grupo hidroxila do Tyr-2462. O Tyr-2462 é completamente invariante, enquanto que o Ala-2448 é parcialmente conservado dos insetos aos mamíferos (Fig. 3). Portanto, a interação entre esses resíduos e o resíduo de aspartato catalítico parece ser importante para manter o Asp-2338 fixado em sua posição particular, significando ainda mais o importante papel desempenhado por esse resíduo. A extensa rede de ligação de hidrogênio no local catalítico mantém a enzima preparada para a ação, orientando e colocando os resíduos catalíticos em suas posições requeridas, muito parecido com aqueles em hidrolases serinas (40).

Palmitoyl Chain Binding Site e Chain Length Specificity. Para obter uma compreensão do mecanismo pelo qual o domínio TE da FAS regula a especificidade do comprimento da cadeia, analisamos a estrutura TE para a presença de um sulco próximo ao centro catalítico que poderia acomodar substratos longos de cadeia de acilo adiposo. A presença de apenas uma ranhura é aparente, que está localizada na interface entre os subdomínios A e B (Fig. 5). A análise utilizando proshape (ver Materiais e Métodos) confirmou a presença da ranhura com um volume de 186,9 Å3 e uma superfície de 140 Å2, cuja extremidade distal forma uma bolsa (Fig. 5). A ranhura está próxima do amino terminal do domínio TE, que está ligado ao domínio ACP da FAS, que detém as cadeias de acilo crescentes para varredura e liberação pelo domínio TE após atingir o comprimento ideal de 16 cadeias de ácido graxo de carbono. A maior parte dos resíduos que formam o sulco tem origem na hélice ampifílica α8 do subdomínio B. Outros resíduos que contribuem para ele são da hélice α5 do subdomínio B, da hélice N-terminal α1 do subdomínio A, e do laço entre β2 e α2 do subdomínio A. Os resíduos que revestem a ranhura, que são na sua maioria hidrófobos na natureza, consistem em Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 e Lys-2426 da hélice α8, Phe-2370 e Phe-2371 da hélice α5, Leu-2222, Leu-2223 e Val-2224 da hélice α1, e Ile-2250 e Glu-2251 do loop entre β2 e α2 (Fig. 5A ). Destes resíduos, Ile-2250, Glu-2251, e Lys-2426 são invariantes entre espécies, enquanto Val-2224, Phe-2371, Ala-2419, e Phe-2423 são em sua maioria conservados (Fig. 3). O resto dos resíduos são completamente conservados em mamíferos (Fig. 3). Todas as observações acima, em conjunto, sugerem a interface entre os dois subdomínios como uma excelente região de ligação da cadeia de ácidos graxos. Duas experiências foram realizadas para dar credibilidade à sugestão e para obter uma visão da seletividade da cadeia de acilo gordo.

Primeiro, demonstramos por mutagénese dirigida ao local que a substituição de vários dos resíduos que revestem a ranhura e a bolsa do domínio TE reduziu a actividade do TE, embora em extensões diferentes (Tabela 2).

Segundo, nós fomos capazes de modelar a ligação de uma cadeia contendo C16 palmitoyl inibidor de hexadecyl sulfonyl f luoride (HDSF) no sulco. A modelagem foi guiada pelos dados da estrutura cristalina da proteína palmitoyl TE 1 (PPT1) com ligação covalente de sulfonato de hexadecilo (HDS) (código PDB ID 1exw; ref. 41) e aumentada pela minimização de energia em cns. Como o TE, o sítio catalítico do PPT1 contém uma tríade catalítica conservada de serina, histidina e aspartato. A estrutura do complexo PPT1-HDS mostrou a formação da ligação covalente entre o átomo de enxofre do HDS e o átomo de oxigênio da serina catalítica e a presença da cadeia de acilo gordo em um longo sulco de superfície da proteína, em sua maioria hidrófobo (41). A modelagem covalente da HDS na estrutura do TE (mostrada na Fig. 5) revelou várias características de ligação ligante com importantes implicações funcionais e bioquímicas. O ajuste da HDS não causou um grande rearranjo dos resíduos no local de ligação. A cadeia palmitoyl faz uma curva acentuada em relação ao grupo sulfonado de forma semelhante à observada na estrutura PPT1 ligada. A cadeia de 16 átomos de carbono palmitoyl encaixa bem dentro da ranhura com os primeiros átomos de carbono ≈12 expostos ao solvente e os restantes ≈4 átomos de carbono inseridos e mantidos no lugar na bolsa distal. Este encaixe é totalmente consistente com a observação de que o mamífero FAS TE catalisa a formação de ácido palmítico como seu principal produto (20). A presença dos últimos átomos de carbono ≈4 na bolsa ajuda a amarrar a cadeia de ácido graxo no local para a hidrólise do substrato de acilo palmitoyl. A natureza do local de ligação, que combina uma ranhura exposta com uma bolsa fechada, é única e concebida para a especificidade deste ET. A descoberta de que o domínio TE dos SAFs de mamíferos não mostra atividade significativa para comprimentos de cadeia de acilo gordo inferiores a 14 átomos de carbono (20) pode ser explicada pela ligação não produtiva devido à falta de amarração e à resultante maior mobilidade das cadeias mais curtas expostas. Os últimos ≈4 átomos de carbono da cadeia de palmitóilo ocupam parcialmente a bolsa distal, deixando espaço suficiente para acomodar apenas 2 átomos de carbono adicionais. Este resultado é consistente com a dramática perda de actividade observada nos substratos do modelo com mais de 18 átomos de carbono (20). Não está claro se os últimos átomos de carbono ≈4 e ≈6 das cadeias de acilo adiposo C16 e C18, respectivamente, serão inseridos numa bolsa pré-formada entre os dois subdomínios, como visto na estrutura da forma não vinculada, ou serão ligados inicialmente a uma forma aberta do domínio que, em seguida, sofre um movimento de dobradiças entre os subdomínios para fechar os átomos de carbono terminais das cadeias de acilo adiposo e criar a configuração produtiva da região ativa do local.

Realizaram-se esforços consideráveis para cristalizar os ET com vários análogos de ácidos gordos de cadeia longa (por exemplo palmitoyl-CoA, miristoil-CoA, estearoil-CoA, ácido palmítico, fluoreto de hexadecil sulfonil, e ácido palmítico), mas não foram encontradas estruturas complexas estáveis de longa duração. A maioria dos complexos, como mostrado pela atividade enzimática independente ou ensaios de ligação radioativa em solução, dissociados dentro de 5 min a 1 h, tornando-os inadequados para cristalização ou ensaios de imersão de cristais.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Embora a estrutura de reconstrução de 20-Å cryo-EM do dimer da FAS humana tenha sido descrita (31), não houve indicação da polaridade N- a C-terminal da subunidade FAS, exceto por uma indicação prévia da marcação de anticorpos de que o domínio FAS TE estava localizado em uma das extremidades de toda a estrutura (42). Tentamos uma avaliação preliminar da polaridade através do acoplamento manual da estrutura menor (32 kDa) do domínio TE da FAS humana, que ocupa a extremidade terminal C da subunidade FAS, e a maior (42 kDa) E. coli β-ketoacyl synthase I (ou KSI) estrutura cristalina (código PDB ID 1ek4) (43), que é um homólogo próximo do domínio N-terminal KS da SAF mamífera, em cada extremidade da unidade monomérica designada cabeça e pé da densidade de massa crio-EM (Fig. 6). A estrutura TE se encaixa bem na ponta da subestrutura designada do pé, enquanto a KSI se encaixa melhor na ponta da cabeça designada da subestrutura (Fig. 6). No Dímero FAS o domínio ACP interage tanto com o domínio TE do mesmo monômero quanto com o domínio cetoacil-sintase no monômero oposto, levando à formação de dois centros ativos nas duas extremidades do dímero. A orientação do domínio TE e do domínio KS homologado para o melhor ajuste no pé e na cabeça, respectivamente, acomoda-se tanto para o espaço como para a interação funcional da molécula ACP com ambas as proteínas. Quando as estruturas foram trocadas o ajuste foi muito mais pobre, com algumas partes do KSI caindo fora da densidade e um volume maior de densidade não contabilizada no ajuste do TE (Fig. 6).

Conclusões. As principais conclusões que podem ser tiradas da estrutura cristalina do domínio TE da FAS humana são as seguintes. (i) O TE é composto por dois subdomínios que diferem em tamanho e motivos dobráveis. (ii) O subdomínio A maior exibe um motivo em β/β, enquanto o subdomínio B menor é todo helicoidal. (iii) O subdomínio A contribui com a tríade catalítica de Ser, Asp, e Seus resíduos. (iv) A ranhura longa com uma bolsa distal entre o subdomínio B e partes do subdomínio A constitui o local de ligação da cadeia de acilo gordo. A geometria e a natureza deste local são consistentes com a alta especificidade do TE em relação aos substratos de acilo adiposo C16 a C18. A ranhura age como uma régua que mede o comprimento correto do substrato. (v) O encaixe preliminar do ETE na estrutura crio-EM da FAS humana intacta sugere uma polaridade plausível dos terminais N a C das subunidades. Entretanto, um mapa crio-EM de maior resolução é necessário para uma verificação posterior do ajuste e uma análise profunda da função FAS.