Le test oxydatif-fermentatif (OF) a été développé par Hugh et Leifson en 1953. Ils ont développé des milieux OF pour différencier les bactéries oxydatives (qui produisent de l’acide à partir de glucides en condition aérobie uniquement) et les bactéries fermentatives (qui produisent de l’acide à la fois en condition aérobie et anaérobie).
Les micro-organismes saccharolytiques dégradent le glucose de manière fermentative ou oxydative. Les produits finaux de la fermentation sont des acides mixtes relativement forts qui peuvent être détectés dans un milieu d’essai de fermentation classique. Cependant, les acides formés lors de la dégradation oxydative du glucose sont extrêmement faibles et moins nombreux, et le milieu de fermentation oxydatif plus sensible du milieu OF de Hugh et Leifson est nécessaire pour la détection. Le milieu a été fabriqué en augmentant la quantité de glucose au-dessus de celle trouvée dans le milieu utilisé pour détecter la fermentation et en diminuant la quantité de peptone.
Le milieu OF de Hugh et Leifson diffère des milieux de fermentation glucidique comme suit :
- La concentration d’agar est diminuée de 3% à 2%, ce qui lui donne une consistance semi-solide (Cela aide à la détermination de la motilité de l’organisme).
- La concentration de peptone est diminuée de 11% à 2%. (Diminution de la quantité de produit alcalin produit par le métabolisme de la peptone ; ce qui réduit l’effet neutralisant de ces produits).
- La concentration en glucides est augmentée de 0,5% à 1.0% (La concentration accrue de glucose dans le milieu augmente la production de ces acides faibles à un niveau qui peut être détecté par l’indicateur bleu de bromthymol.)
Principe:
Le test oxydatif-fermentaire détermine si certains bâtonnets gram-négatifs métabolisent le glucose par fermentation ou par respiration aérobie (de manière oxydative). Au cours du processus anaérobie de fermentation, le pyruvate est converti en une variété d’acides mixtes selon le type de fermentation. La forte concentration d’acide produite pendant la fermentation fera passer l’indicateur bleu de bromthymol dans les milieux OF du vert au jaune en présence ou en l’absence d’oxygène .
Certaines bactéries gram-négatives non fermentaires métabolisent le glucose en utilisant la respiration aérobie et ne produisent donc qu’une petite quantité d’acides faibles pendant la glycolyse et le cycle de Krebs. La diminution de la quantité de peptone et l’augmentation de la quantité de glucose facilitent la détection des acides faibles ainsi produits. Un tampon de phosphate dipotassique est ajouté pour favoriser davantage la détection des acides.
Utilisations:
Le testOF est utilisé pour déterminer si les bactéries gram-négatives métabolisent les hydrates de carbone de manière oxydative, par fermentation, ou sont non sacchrolytiques (n’ont pas la capacité d’utiliser les hydrates de carbone dans le milieu).
Milieu :
Milieu basal OF de Hugh et Leifson ; les constituants sont les suivants :
- Chlorure de sodium : 5,0 g
- Phosphate di-potassique : 0,3 g
- Peptone : 2.0 g
- Bleu de bromthymol :0,03 g
- Agar : 3,0 g
- Glucose : 10 g
- Eau : 1000 ml
Le pH doit être ajusté à 7,1 avant l’autoclavage. Après autoclavage du milieu à 121°C pendant 15 minutes, une solution stérilisée par filtration de 10% de glucides est ajoutée aseptiquement au milieu jusqu’à une concentration finale de 1%.
Procédure
- Inoculer deux tubes de milieu d’essai OF avec l’organisme à tester à l’aide d’un fil droit en poignardant « à mi-chemin du fond » du tube.
- Couvrir un tube de chaque paire avec une couche de 1 cm d’huile minérale stérile ou de paraffine liquide (cela crée une condition anaérobie dans le tube en empêchant la diffusion de l’oxygène), en laissant l’autre tube ouvert à l’air.
- Incuber les deux tubes à 35°C pendant 48 heures (Les bactéries à croissance lente peuvent prendre 3 à 4 jours avant que les résultats puissent être observés)
Interprétation
La production d’acide est détectée dans le milieu par l’apparition d’une couleur jaune. Dans le cas d’organismes oxydatifs ; la production de couleur peut être d’abord notée près de la surface du milieu.
Suivant sont les modèles de réaction :
- Résultat fermentaire : Production d’acide sur les deux tubes (ouvert et couvert). L’acide produit fait passer l’indicateur de pH, le bleu de bromthymol, du vert au jaune. par exemple Escherichia coli
- Résultat oxydatif : La production d’acide dans le tube ouvert (aérobie) et non dans le tube recouvert d’huile (anaérobie) indique un résultat oxydatif. Les bactéries non fermentaires qui métabolisent le glucose par oxydation donnent un résultat oxydatif. Par exemple, Pseudomonas aeruginosa
- Non saccharolytique (résultat OF négatif) : Les bactéries non saccharolytiques donnent un résultat OF négatif. Le résultat négatif est indiqué par l’absence de changement de couleur dans le tube recouvert d’huile et, dans certains cas, par une augmentation du pH (pH 7,6) faisant passer le bleu de bromthymol du vert au bleu dans la partie supérieure du tube ouvert. L’augmentation du pH est due à la production d’amines par les bactéries qui dégradent la peptone (protéine) du milieu.
e.g. Alcaligenes faecalis.
Contrôle de qualité
- Fermenteur de glucose : Escherichia coli
- Fermenteur de glucose : Pseudomonas aeruginosa
- Nonsaccharolytique : Moraxella species
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