Synthase d’acides gras humaine : Structure et sélectivité du substrat du domaine thioestérase

Les trois résidus catalytiques du TE FAS humain (Ser-2308, His-2481, et Asp-2338) sont liés entre eux et aux résidus voisins par un vaste réseau de liaisons hydrogène (Fig. 4). Le groupe hydroxyle de Ser-2308 est impliqué dans une liaison hydrogène coopérative, acceptant du squelette amide adjacent de Tyr-2309 et donnant au Nε2 de His-2481. Ceci, à son tour, faciliterait l’activation de Ser-2308 en tant que nucléophile et aiderait à stabiliser l’intermédiaire tétraédrique d’oxyanion qui devrait se former pendant la réaction catalytique TE comme on le voit dans les sérine hydrolases. Le résidu His-2481 (Nε2) est à son tour lié par hydrogène à Asp-2338 (Oδ2). L’Asp-2338 (atome Oδ1) établit des liaisons hydrogène supplémentaires à la fois avec l’amide du squelette de Ala-2448 et le groupe hydroxyle de Tyr-2462. Tyr-2462 est complètement invariant, alors que Ala-2448 est partiellement conservé des insectes aux mammifères (Fig. 3). Par conséquent, l’interaction entre ces résidus et le résidu aspartate catalytique semble être importante pour maintenir l’Asp-2338 fixé dans sa position particulière, ce qui signifie encore le rôle important joué par ce résidu. Le vaste réseau de liaisons hydrogène au niveau du site catalytique maintient l’enzyme amorcée pour l’action en orientant et en plaçant les résidus catalytiques à leurs positions requises, tout comme ceux des sérine hydrolases (40).

Spécificité du site de liaison de la chaîne palmitoyle et de la longueur de la chaîne. Pour mieux comprendre le mécanisme par lequel le domaine TE de FAS régule la spécificité de la longueur de la chaîne, nous avons analysé la structure TE pour la présence d’un sillon proche du centre catalytique qui pourrait accueillir des substrats à longue chaîne d’acyle gras. La présence d’un seul sillon est apparente, qui est situé à l’interface entre les sous-domaines A et B (Fig. 5). L’analyse à l’aide de proshape (voir Matériaux et Méthodes) a confirmé la présence du sillon d’un volume de 186,9 Å3 et d’une surface de 140 Å2, dont l’extrémité distale forme une poche (Fig. 5). Le sillon est proche de l’extrémité amino-terminale du domaine TE, qui est liée au domaine ACP de FAS qui retient les chaînes acyles en croissance pour qu’elles soient scannées et libérées par le domaine TE après avoir atteint la longueur optimale de la chaîne d’acides gras à 16 carbones. La plupart des résidus qui bordent le sillon proviennent de l’hélice amphiphile α8 du sous-domaine B. D’autres résidus qui y contribuent proviennent de l’hélice α5 du sous-domaine B, de l’hélice N-terminale α1 du sous-domaine A, et de la boucle entre β2 et α2 du sous-domaine A. Les résidus bordant le sillon, qui sont principalement de nature hydrophobe, sont constitués de Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 et Lys-2426 de l’hélice α8, Phe-2370 et Phe-2371 de l’hélice α5, Leu-2222, Leu-2223 et Val-2224 de l’hélice α1, et Ile-2250 et Glu-2251 de la boucle entre β2 et α2 (Fig. 5A ). Parmi ces résidus, Ile-2250, Glu-2251 et Lys-2426 sont invariants entre les espèces, tandis que Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 et Phe-2423 sont principalement conservés (Fig. 3). Le reste des résidus est complètement conservé chez les mammifères (Fig. 3). Toutes les observations ci-dessus prises ensemble suggèrent que l’interface entre les deux sous-domaines est une excellente région de liaison des chaînes d’acides gras. Deux expériences ont été entreprises pour donner du crédit à cette suggestion et pour obtenir un aperçu de la sélectivité de la chaîne d’acyle gras.

Premièrement, nous avons démontré par mutagenèse dirigée vers le site que les remplacements de plusieurs des résidus tapissant la rainure et la poche du domaine TE réduisaient l’activité TE, bien qu’à des degrés différents (tableau 2).

Deuxièmement, nous avons pu modéliser la liaison d’un inhibiteur contenant une chaîne palmitoyle en C16, l’hexadécyl sulfonyl f luoride (HDSF), dans le sillon. La modélisation a été guidée par les données de la structure cristalline de la protéine palmitoyle TE 1 (PPT1) avec l’hexadécyl sulfonate (HDS) lié de manière covalente (code PDB ID 1exw ; réf. 41) et augmentée par la minimisation de l’énergie dans le cns. Comme le TE, le site catalytique de PPT1 contient une triade catalytique conservée de sérine, histidine et aspartate. La structure du complexe PPT1-HDS a montré la formation de la liaison covalente entre l’atome de soufre de HDS et l’atome d’oxygène de la sérine catalytique et la présence de la chaîne acyle grasse dans un long sillon superficiel principalement hydrophobe de la protéine (41). La HDS modélisée liée de façon covalente dans la structure TE (montrée dans la Fig. 5) a révélé plusieurs caractéristiques de la liaison du ligand avec des implications fonctionnelles et biochimiques importantes. L’ajustement de l’HDS n’a provoqué aucun réarrangement majeur des résidus dans le site de liaison. La chaîne palmitoyle fait un coude prononcé par rapport au groupe sulfonate de manière similaire à celle observée dans la structure PPT1 liée. La chaîne palmitoyle de 16 atomes de carbone s’ajuste bien dans le sillon avec les premiers ≈12 atomes de carbone exposés au solvant et les ≈4 atomes de carbone restants insérés et maintenus en place dans la poche distale. Cet ajustement est tout à fait cohérent avec l’observation que le FAS TE des mammifères catalyse la formation d’acide palmitique comme son produit principal (20). La présence des derniers ≈4 atomes de carbone dans la poche permet d’attacher la chaîne d’acide gras en place pour l’hydrolyse du substrat acyle palmitoyle. La nature du site de liaison, qui combine un sillon exposé et une poche fermée, est unique et conçue pour la spécificité de ce TE. La constatation que le domaine TE des FAS de mammifères ne présente aucune activité significative envers les longueurs de chaîne d’acyle gras inférieures à 14 atomes de carbone (20) peut s’expliquer par une liaison non productive due à l’absence d’attache et à la plus grande mobilité résultante des chaînes plus courtes exposées. Les derniers ≈4 atomes de carbone de la chaîne palmitoyle occupent partiellement la poche distale, laissant suffisamment d’espace pour accueillir seulement 2 atomes de carbone supplémentaires. Ce résultat est cohérent avec la perte spectaculaire d’activité observée avec des substrats modèles de plus de 18 atomes de carbone (20). Il n’est pas clair si les derniers atomes de carbone ≈4 et ≈6 des chaînes acyles gras C16 et C18, respectivement, seront insérés dans une poche préformée entre les deux sous-domaines comme on le voit dans la structure de la forme non liée, ou seront liés initialement à une forme ouverte du domaine qui subit ensuite un mouvement de flexion en charnière entre les sous-domaines pour enfermer les atomes de carbone terminaux des chaînes acyles gras et créer la configuration productive de la région du site actif.

Des efforts considérables ont été faits pour cristalliser la TE avec divers analogues d’acides gras à longue chaîne (par ex, palmitoyl-CoA, myristoyl-CoA, stearoyl-CoA, acide palmitique, fluorure d’hexadécyl sulfonyle et acide palmitique), mais aucune structure complexe stable à long terme n’a été trouvée. La plupart des complexes, comme l’ont montré les essais indépendants d’activité enzymatique ou de liaison radioactive en solution, se sont dissociés en 5 min à 1 h, ce qui les rend impropres à la cristallisation ou aux essais de trempage des cristaux.

Ajustement cryo-EM de la structure TE. Bien que la structure de reconstruction cryo-EM de 20 Å du dimère FAS humain ait été décrite (31), il n’y avait aucune indication de la polarité N- à C-terminale de la sous-unité FAS, à l’exception d’une indication précédente provenant du marquage d’anticorps que le domaine TE de FAS était situé à l’une des extrémités de la structure entière (42). Nous avons tenté une évaluation préliminaire de la polarité en amarrant manuellement la structure plus petite (32 kDa) du domaine TE de FAS humain, qui occupe l’extrémité C-terminale de la sous-unité FAS, et la structure plus grande (42 kDa) du β-cétoacide de E. coli. coli β-ketoacyl synthase I (ou KSI) (PDB ID code 1ek4) (43), qui est un proche homologue du domaine KS N-terminal de FAS mammifère, dans chaque extrémité de l’unité monomère désignée tête et pied de la densité de masse cryo-EM (Fig. 6). La structure TE s’adapte bien à l’extrémité de la sous-structure désignée par le pied, tandis que le KSI s’adapte mieux à l’extrémité de la sous-structure désignée par la tête (Fig. 6). Dans le dimère FAS, le domaine ACP interagit à la fois avec le domaine TE du même monomère et avec le domaine cétoacyl-synthase du monomère opposé, ce qui entraîne la formation de deux centres actifs aux deux extrémités du dimère. L’orientation du domaine TE et de l’homologue du domaine KS pour le meilleur ajustement au pied et à la tête, respectivement, tenait compte de l’espace et de l’interaction fonctionnelle de la molécule ACP avec les deux protéines. Lorsque les structures ont été permutées, l’ajustement était beaucoup moins bon, avec certaines parties de KSI tombant en dehors de la densité et un plus grand volume de densité non comptabilisé dans l’ajustement TE (Fig. 6).

Conclusions. Les principales conclusions que l’on peut tirer de la structure cristalline du domaine TE du FAS humain sont les suivantes . (i) Le TE est composé de deux sous-domaines qui diffèrent en taille et en motifs de repliement. (ii) Le plus grand sous-domaine A présente un motif α/β, tandis que le plus petit sous-domaine B est entièrement hélicoïdal. (iii) Le sous-domaine A contribue à la triade catalytique des résidus Ser, Asp et His. (iv) Le long sillon avec une poche distale entre le sous-domaine B et des parties du sous-domaine A constitue le site de liaison de la chaîne d’acyle gras. La géométrie et la nature de ce site sont cohérentes avec la haute spécificité de la TE envers les substrats d’acyle gras C16 à C18. Le sillon agit comme une règle qui mesure la longueur correcte du substrat. (v) L’ajustement préliminaire du TE dans la structure cryo-EM du FAS humain intact suggère une polarité plausible de l’extrémité N à C des sous-unités. Cependant, une carte cryo-EM de plus haute résolution est nécessaire pour vérifier davantage l’ajustement et une analyse approfondie de la fonction de FAS.