Résultats et discussion
L’activation inconstante du facteur de transcription NF-κB est considérée comme essentielle pour la transformation des cellules B par la protéine de fusion API2-MALT1 des lymphomes MALT avec une translocation t(11;18) . La surexpression transitoire de API2-MALT1 dans les cellules 293T entraîne l’activation robuste d’un gène rapporteur de la luciférase NF-κB, fournissant ainsi un système modèle utile pour étudier les mécanismes par lesquels API2-MALT1 signale NF-κB. Pour contrôler l’efficacité de la transfection, nous avons co-exprimé pEGFP-N2 (Clontech) dans un certain nombre d’expériences. À notre grande surprise, nous avons observé que l’EGFP inhibait l’activation du NF-κB induite par API2-MALT1 de manière dose-dépendante (Fig 1A). En revanche, l’EGFP n’a pas affecté l’activation du rapporteur induite par l’expression des sous-unités p50/p65 de NF-κB (Fig 1B), suggérant une interférence avec la cascade de signalisation NF-κB activée par API2-MALT1 en amont de NF-κB.
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(A) L’activation d’un rapporteur de luciférase NF-κB par une protéine de fusion API2-MALT1 marquée d’un drapeau est inhibée par l’EGFP de manière dose dépendante.
(B) L’EGFP ne bloque pas l’activité luciférase dépendante de NF-κB induite par l’expression des sous-unités p50/p65 de NF-κB. (C) L’activation d’un rapporteur luciférase NF-κB par une protéine de fusion Flag-API2-.MALT1 est inhibée par l’EGFP mutée pour le motif de liaison TRAF6 (D) L’EGFP mais pas la pmaxGFP empêche l’activation induite par le TNF-α du rapporteur de la luciférase NF-κB et la phosphorylation de IκB-α et JUN dans les cellules 293T.
L’EGFP n’augmente pas les niveaux de HSP70 ni n’induit HSP70B′ dans les cellules 293T.
Les intensités de fluorescence (Ex485/Em520nm) pour l’EGFP et la pmaxGFP étaient toutes deux ∼100 fois supérieures au bruit de fond. (E) Les protéines de fusion EGFP N- et/ou C-terminales (pour API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actin, Rab5, Syndecan binding protein 2 (SDCBP2) ou β-Tubulin) et EGFP avec un signal de localisation nucléaire (NLS) ou un site de farnysilation (pEGFP-F) réduisent l’activité du rapporteur luciférase NF-κB induite par le TNF-α dans les cellules 293T. En bas : Chez l’homme, HSP70 est exprimé de façon constitutive dans des conditions normales, mais Hsp70B′ n’est induit qu’en réponse au stress.
Il n’y a pas d’expression basale de Hsp70B′.
Comme contrôle positif de l’expression de HSP70B′, les cellules 293T (voie 2) ont subi un choc thermique à 44°C pendant deux heures (voie 3) et ont pu récupérer à 37°C pendant 5 (voie 4) ou 18 (voie 5) heures avant la récolte. L’activité de la luciférase dépendante de NF-κB est représentée pour chaque expérience en tant que pli d’induction des cellules transfectées par vecteur et est représentée graphiquement comme la moyenne et l’écart-type d’au moins trois expériences indépendantes.
Toutes les normes de poids moléculaire sont en kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 est un composant de signalisation essentiel de la voie antigène-récepteur vers NF-κB , . On pense que BCL10 est le médiateur de l’oligomérisation de MALT1, ce qui permet la formation d’un complexe avec TRAF6. L’oligomérisation de TRAF6 déclenche l’activité ubiquitine ligase E3 de son domaine RING, ce qui entraîne la modification de IKKγ (NEMO) par des chaînes de polyubiquitine liées à Lys63. Ceci facilite ensuite l’interaction de IKKγ avec la TGFβ activating kinase 1 (TAK1), qui active pleinement le complexe IκB kinase (IKK) via la phosphorylation de IKKβ , conduisant ainsi à l’activation de NF-κB. De même, la protéine de fusion API2-MALT1 active NF-κB via la polyubiquitination de IKKγ médiée par TRAF6. L’interaction de TRAF6 avec l’extrémité carboxy de MALT1 se fait par l’intermédiaire de deux motifs de liaison TRAF6 potentiels (PxExxAr/Ac avec Ar/Ac pour un résidu aromatique ou acide). L’inspection de la séquence EGFP a révélé la présence d’un consensus de liaison à TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). La structure cristalline d’EGFP montre que le motif PNEKRD est exposé dans une boucle entre deux feuilles bêta, ce qui suggère son accessibilité et un rôle d’EGFP en tant que régulateur négatif via la séquestration de TRAF6. Cependant, les expériences de co-IP n’ont pas permis de démontrer une interaction entre EGFP et TRAF6 (données non montrées) et les mutants pour le consensus de liaison de TRAF6 ont bloqué l’activation du NF-κB par API2-MALT1 aussi efficacement que EGFP (Fig 1C).
Pour vérifier si l’effet était limité à API2-MALT1, nous avons analysé l’activation du NF-κB induite par le TNF-α dans des cellules 293T exprimant EGFP. Là encore, l’EGFP a réduit la signalisation du NF-κB, comme le montre la diminution de l’activité du rapporteur et de la phosphorylation de l’inhibiteur du NF-κB, IκB-α (Fig 1D). Nous avons ensuite évalué si les protéines de fusion EGFP pouvaient avoir le même effet. Les fusions EGFP N- et C-terminales ont bloqué l’activation du NF-κB induite par API2-MALT1 (données non présentées) et par le TNFα (Fig. 1E). Outre l’activation de la voie NF-κB, le traitement par le TNF-α déclenche également la signalisation JNK. La phosphorylation de JUN, indicative de l’activation de la signalisation JNK, est réduite par l’EGFP également après le traitement TNF-α (Fig 1D).
Il a été rapporté que la visualisation prolongée de cellules exprimant la GFP induit la production d’espèces réactives de l’oxygène, ce qui peut entraîner des changements physiologiques et finalement la mort cellulaire . De manière intéressante, les deux mutants EGFP pour le consensus de liaison TRAF6 avaient perdu leur fluorescence verte mais inhibaient efficacement la signalisation NF-κB (Fig 1C). En outre, la pmaxGFP (Amaxa Biosystems), une protéine fluorescente structurellement différente, n’a pas eu d’effet sur l’activation du NF-κB et de la JNK après traitement par le TNF-α (Fig. 1D), ce qui suggère que l’inhibition ne résulte pas d’une phototoxicité associée aux radicaux libres. Une autre étude a indiqué que des niveaux élevés d’EGFP peuvent induire la protéine de choc thermique 70 (HSP70), qui est capable d’inhiber l’activation de NF-κB via son interaction avec IKKγ et TRAF6. Cependant, l’induction de HSP70 était limitée aux cellules endothéliales et nous n’avons pas observé d’augmentation des niveaux de HSP70 ou d’induction de HSP70B′ dans les cellules 293T exprimant l’EGFP (Fig 1D-E).
L’activation de NF-κB par l’expression de API2-MALT1 ou lors du traitement par TNF-α est associée à la modification de IKKγ avec de la polyubiquitine liée à Lys63 par TRAF6 ou TRAF2 respectivement , . En outre, la signalisation de JNK induite par le TNFα nécessite l’auto-ubiquitination de TRAF2. Afin d’évaluer un éventuel effet de l’EGFP sur l’activité ubiquitine ligase E3 RING de TRAF6 ou TRAF2, nous avons contrôlé l’ubiquitination par l’intermédiaire d’un mutant d’ubiquitine marqué HA avec seulement Lys63 disponible pour la polymérisation (HA-Ub-K63). L’expression de API2-MALT1 ou la stimulation du TNF-α a augmenté le niveau de protéines polyubiquitinées dans les cellules 293T et a été associée à une polyubiquitination accrue de IKKγ dans les immunoprécipités, et les deux processus ont été bloqués par l’EGFP (Fig 2A, voies 1,2,5,6). De plus, l’EGFP a réduit le niveau basal de polyubiquitination liée à K63 dans les cellules 293T (Fig 2A, voies 3 et 4). De même, l’expression de API2-MALT1 ou le traitement par le TNFα stimule l’assemblage de chaînes d’ubiquitine liées à K48, qui est à nouveau bloqué par l’EGFP et son homologue structurel dsRed (Clontech) mais pas par la pmaxGFP (Fig 2B).
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(A) Les cellules 293T transfectées avec les constructions indiquées et traitées pendant 4 heures avec 20 ng/ml de TNF-α (voie 5 et 6) ont été immunoblottées avec des anticorps anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) et anti-EGFP (panneau de gauche) ou les immunoprécipités anti-IKKγ ont été immunoblotés avec des anticorps anti-Flag (IKKγ) ou anti-HA (ubiquitine) (panneau de droite).
(B) L’EGFP affecte la polyubiquitination liée à K48.
Les cellules 293T ont été transfectées avec une construction Ubiquitine avec seulement Lys48 disponible pour la polymérisation (HA-Ub-K48), traitées pendant 4 heures avec 20 ng/ml TNF-α ou laissées non traitées et les lysats cellulaires ont été immunoblotés avec des anticorps anti-HA (Ub-K48) et anti-EGFP.
Les intensités de fluorescence (Excitation 485/Emission 520 nm) pour EGFP et pmaxGFP étaient comparables (∼100 fold higher then background values), l’expression de pDs-Red a été confirmée par microscopie à fluorescence.
(C) L’EGFP stabilise API2-Myc exogène dans les cellules 293T via la réduction de son auto-ubiquitination liée à Lys48 et de sa dégradation protéasomique.
(D) L’expression stable de l’EGFP dans la lignée cellulaire de carcinome à cellules merkel MCC14.2 réduit la polyubiquitination et augmente les niveaux d’expression de p53 endogène.
Le rapport moyen et l’écart-type des signaux de p53 par rapport à l’actine sont donnés (trois expériences indépendantes), (Ub)n : protéines polyubiquitinées.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Pour étudier si l’EGFP affecte exclusivement l’ubiquitination par les protéines TRAF, nous avons évalué API2, une ubiquitine ligase E3 RING qui se déstabilise elle-même via une auto-ubiquitination liée à Lys48 . La co-expression de l’EGFP a inhibé la polyubiquitination induite par API2 dans les cellules 293T, entraînant une augmentation des niveaux d’expression de API2 (Fig 2C). Des niveaux réduits d’ubiquitination à l’état stable ont également été observés dans les cellules MCC14.2 avec une expression stable de l’EGFP. En conséquence, les niveaux basaux de p53 endogène, qui sont étroitement régulés par l’ubiquitination liée à Lys48 par MDM2, sont légèrement augmentés dans les cellules exprimant l’EGFP (Fig 2D).
Puis nous avons examiné si l’EGFP affecte l’ubiquitination in vivo. Les niveaux basaux de polyubiquitination étaient réduits dans les lymphocytes spléniques de souris transgéniques EGFP , ce qui était associé à une réduction de la phosphorylation de IκB-α après stimulation antigénique par rapport aux souris témoins, ce qui indique que l’EGFP réduit l’activation de NF-κB induite par les récepteurs des cellules B (Fig 3A-B). Les souris transgéniques API2-MALT1 présentent un déficit de cellules B B220+/CD40+ dans leur moelle osseuse, car l’activation du NF-κB médiée par API2-MALT1 accélère leur maturation en cellules B naïves. Lorsque ces souris transgéniques API2-MALT1 ont été croisées avec des souris EGFP, le déficit de cellules B B220+/CD40+ dans la moelle osseuse des souris transgéniques doubles EGFP/API2-MALT1 (Fig 3C) a été restauré, ce qui confirme l’impact sur l’ubiquitination et la signalisation NF-κB in vivo. De même, la polyubiquitination était réduite dans les cellules hépatiques des souris EGFP et était associée à la stabilisation de p53 comme le montre l’augmentation de son niveau d’expression (Fig 3A, D). Le principal gène cible de p53 lors de dommages à l’ADN induits par l’irradiation γ dans le foie est p21, qui est nécessaire pour l’arrêt du cycle cellulaire et la réparation de l’ADN. Par conséquent, les lésions de l’ADN induites par l’irradiation γ ont non seulement provoqué une réponse plus élevée de p53 chez les souris EGFP, mais l’induction de p21 a également été légèrement augmentée (Fig 3D). Enfin, des expériences in vitro ont été réalisées pour évaluer si l’EGFP affecte directement l’assemblage de la chaîne d’ubiquitine ; cependant, l’EGFP recombinant n’a pas affecté la polyubiquitination d’un substrat de contrôle (Fig 3E), suggérant un effet dépendant du contexte cellulaire de l’EGFP sur l’ubiquitination.
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(A) Western blots d’extraits de rate et de foie de souris FVB de type sauvage (wt) et transgénique EGFP détectés avec des anticorps contre l’Ubiquitine, l’EGFP et l’actine (contrôle de chargement).
(B) L’EGFP réduit la phosphorylation de IκB-α dans les lymphocytes B stimulés par anti-IgM/anti-CD40 purifiés à partir de souris EGFP.
Expériences réalisées en triplicata, une image représentative d’une expérience est montrée.
La moyenne et les écarts types des ratios de IκB-α-P par rapport à l’actine par rapport aux cellules non stimulées sont donnés.
(C) Le déficit de cellules B B220+/CD40+ dans la moelle osseuse des souris API2-MALT1 est restauré chez les souris transgéniques doubles EGFP/API2-MALT1.
Expériences réalisées en triplicata, la moyenne et les écarts types sont représentés. eMalt1 : Malt1 endogène, bande spécifique *a (D) Les souris EGFP présentent des niveaux accrus de p53 dans le foie et ont des réponses p53/p21 améliorées lors de dommages à l’ADN induits par une irradiation γ.
La moyenne et les écarts types des rapports des signaux p53/p21 sur l’actine par rapport à celui de l’échantillon 1 sont donnés.
(E) L’EGFP recombinant (rEGFP) n’empêche pas la polyubiquitination d’un substrat Biotin-Lysozyme in vitro. (Ub)n : protéines polyubiquitinées.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
En conclusion, nos données indiquent que l’EGFP et les protéines de fusion EGFP affectent les processus dépendants de l’ubiquitine ligase E3 RING comme la signalisation NF-κB et JNK ou l’homéostasie de p53 dans les lignées cellulaires et chez la souris. NF-κB joue un rôle central dans la régulation de divers processus biologiques, notamment l’immunité innée et adaptative, le développement, la croissance cellulaire et la survie. Les signaux pro-survivants résultent de l’expression élevée d’inhibiteurs de l’apoptose, tels que la leucémie/lymphome-XL à cellules B. Par conséquent, l’augmentation de l’apoptose induite par l’EGFP dans les cellules ou dans le cortex moteur et le striatum du cerveau des souris pourrait être liée à une réduction de l’activité de NF-κB due à une polyubiquitination défectueuse et à l’activation/dégradation de ses régulateurs en amont. On suppose également qu’une ubiquitination défectueuse est à l’origine de la dystrophie musculaire des ceintures, qui est associée à des mutations de Trim32, une ubiquitine ligase de l’actine. Comme il a été démontré que l’EGFP altère les interactions entre l’actine et la myosine dans les cellules musculaires et induit une cardiomyopathie dilatée chez les souris EGFP, il est tentant de supposer que l’ubiquitination de l’actine pourrait jouer un rôle essentiel dans le fonctionnement normal du muscle et que sa dérégulation par l’EGFP est à l’origine des phénotypes susmentionnés. Par conséquent, compte tenu du rôle émergent de l’ubiquitination dans de nombreux processus cellulaires, l’utilisation de l’EGFP comme rapporteur de cellules vivantes doit être soigneusement étudiée.
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