Les allèles mutants Trp53 null et R270H ont des effets comparables dans la régulation de l’invasion, des métastases et de l’expression des gènes dans la tumorigenèse du côlon chez la souris

Les mutations de Trp53 missense et null favorisent la progression des tumeurs du côlon chez la souris CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK)

Pour développer un modèle de tumeur du côlon de souris instigué par des défauts de gènes comme ceux souvent présents dans les tumeurs du côlon humain, nous avons généré des souris mutantes composées portant un allèle Apc floxé (Apcflox, 580S, abrégé en A) qui pourrait être inactivé par la fonction de recombinaison de Cre et un allèle floxé, oncogène latent de Kras (KrasLSL-G12D, abrégé en K) qui pourrait être activé par la recombinaison de Cre. En utilisant le transgène CDX2P-CreERT2 et le traitement TAM pour activer la fonction de Cre dans les cellules épithéliales du colon, nous avons ciblé les allèles Apc et Kras dans l’épithélium de l’iléon distal, du cæcum et du colon. Alors que les souris CDX2P-CreERT2 K présentent un épithélium du côlon dentelé et hyperplasique, les souris CDX2P-CreERT2AK (AK) ont un épithélium du côlon dentelé et hyperplasique et ont également développé une moyenne de 13 adénomes dont la taille varie de 0,5 mm à 2 mm au moment où les critères d’évaluation humaine ont été atteints pour les souris, 10 à 15 mois après le traitement TAM (Fig. 1a). Chez six des 10 souris AK, nous avons trouvé un ou deux adénocarcinomes apparaissant dans le cæcum. Sur les huit adénocarcinomes trouvés au total chez les 10 souris AK étudiées, sept tumeurs ont envahi la muscularis propria (MP) ou plus profondément et cinq ont atteint la sous-séreuse ou la séreuse (Fig. 1b, Tableau 1 et Tableau supplémentaire 1). Cependant, étant donné que seules 8 des 131 tumeurs observées chez les souris AK étaient invasives, ces résultats impliquent que des défauts somatiques supplémentaires, outre les mutations Apc et Kras, étaient nécessaires au développement de tumeurs invasives du côlon chez les souris AK.

Les mutations absentes et nulles de Trp53 favorisent la progression des tumeurs du côlon chez les souris CDX2P-CreERT2 Apcfl/+, KrasLSL-G12D (AK). a Courbes de survie Kaplan-Meier des souris CDX2P-CreERT2AK (AK) (n = 10, survie médiane = 336 jours), des souris CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) (n = 16, survie médiane = 166 jours), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) (n = 16, survie médiane = 97 jours) et CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) (n = 20, survie médiane = 88 jours). Le TAM a été administré quotidiennement pendant deux jours et le temps zéro représente le deuxième de ces jours. Les valeurs P ont été obtenues par le test log-rank dans les comparaisons suivantes : P = 1,4E-6 pour AK par rapport à AKP270/+ ; P = 1,4E-7 pour AKPfl/fl par rapport à AKP270/+ ; P = 1,9E-8 pour AKP270/fl par rapport à AKP270/+. b Pourcentage de tumeurs du côlon présentant différentes profondeurs d’invasion chez les souris AK, AKP270/+, AKPfl/fl et AKP270/fl. Les données proviennent de plusieurs lésions par souris (n = 10-14 souris par groupe). Les valeurs P basées sur les tests exacts de Fisher et les tests de Poisson exacts sont présentées dans le tableau 1 et le tableau supplémentaire 1, respectivement. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. A adénome, SM sous-muqueuse, MP muscularis propria, SS sous-séreuse, S séreuse. c, d Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) de tumeurs invasives représentatives des tissus du côlon proximal (à droite) et du cæcum (à gauche) pour les souris AKP270/fl (c) et les souris AKPfl/fl (d). Les tumeurs en (c) et (d) ont été collectées 3 mois après l’injection de TAM. Les images à fort grossissement sont présentées dans les panneaux inférieurs et sont encadrées dans les zones à faible grossissement dans les panneaux supérieurs correspondants. Les lignes pointillées indiquent la limite entre la couche musculaire et la sous-séreuse. Barres d’échelle : 500 μm pour l’image à faible grossissement (panneaux supérieurs) ; 100 μm pour les images à fort grossissement (panneaux inférieurs)

Comme indiqué ci-dessus, les mutations de TP53 sont présentes dans environ 60 % des CCR humains et semblent être sélectionnées au cours de la progression des adénomes-carcinomes . Nous avons cherché à évaluer la coopération de l’inactivation de Trp53 avec les mutations d’Apc et de Kras dans la progression des tumeurs du côlon in vivo, ainsi qu’à déterminer si les effets GOF potentiels d’un allèle mutant faux-sens de Trp53 pouvaient être observés dans le modèle. Nous avons introduit un allèle mutant constitutif Trp53R270H (l’équivalent murin du R273H humain, appelé P270) et/ou un allèle nul conditionnel Trp53flox (appelé Pfl) dans le modèle AK. Des souris avec des génotypes composés ont été générées et leurs abréviations sont les suivantes : CDX2P-CreERT2AKP270/+ (souris AKP270/+), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (souris AKP270/fl) et CDX2P-CreERT2AKPfl/fl(souris AKPfl/fl). Des cohortes de souris adultes AKP270/+, AKP270/fl et AKPfl/fl ont été induites en tumeurs du côlon par le traitement TAM et leur état de santé a été suivi. Comparées aux souris AK (survie médiane = 336 jours), les souris AKP270/+, AKP270/fl et AKPfl/fl avaient toutes une durée de vie significativement réduite. Les souris AKP270/fl et AKPfl/fl avaient une survie médiane de 88 et 97 jours, respectivement, et les souris AKP270/+ avaient une survie médiane de 166 jours (Fig. 1a). Les souris AKP270/+ avaient une survie significativement plus longue que les souris AKP270/fl et AKPfl/fl (P < 0,0001 pour chaque comparaison avec les souris AKP270/+), mais aucune différence de survie statistiquement significative n’a été observée en comparant les souris AKP270/fl et AKPfl/fl (Fig. 1a). L’ajout de la ou des mutations Trp53 (R270H ou nulles) a augmenté de manière significative l’incidence globale des tumeurs par rapport à celle observée chez les souris AK (P < 0,0001 pour les souris AKPfl/fl et AKP270/fl, par rapport aux souris AK, tableau supplémentaire 1 en bas à gauche). Les souris AKP présentaient également de multiples tumeurs du côlon et du cæcum qui présentaient des caractéristiques invasives (7,3 et 8,9 tumeurs invasives par souris pour les souris AKPfl/fl et AKP270/fl, respectivement) par rapport aux souris AK (0,8 tumeur invasive par souris ; Fig. 1b et Tableau supplémentaire 1 en haut à droite, P < 0,0001 pour les souris AKPfl/fl par rapport aux souris AK et AKP270/fl. Une analyse approfondie des tissus du cæcum et du côlon des souris obtenus lors de l’autopsie a permis de définir la charge tumorale importante chez les souris AKP270/+, AKPfl/fl et AKP270/fl, avec des lésions allant des adénomes aux adénocarcinomes de stade avancé (Fig. 1b-d et Tableau 1). Toutes les souris AKP270/+, AKPfl/fl et AKP270/fl étudiées étaient porteuses d’au moins un adénocarcinome (tumeurs avec invasion de la sous-muqueuse ou plus profonde). Des signes d’invasion des muscles lisses et, dans certains cas, de la séreuse ont été trouvés dans les régions du cæcum et du côlon proximal des souris AKP270/fl et AKPfl/fl (Fig. 1c, d, respectivement). Les souris AKP270/+, dont les cellules épithéliales ciblées par Cre conservent initialement un allèle Trp53 de type sauvage fonctionnel, ont eu une période de latence plus longue pour le développement de la tumeur et la charge tumorale globale (18,5 par souris) et les pourcentages de tumeurs avec une invasion plus profonde (11.9%) étaient significativement plus faibles par rapport aux souris AKP270/fl ou AKPfl/fl (tableau supplémentaire 1 et tableau 1, P < 0,01 par rapport aux souris AKP270/fl ou AKPfl/fl pour la charge tumorale par souris et les pourcentages d’adénocarcinomes). Ces résultats soutiennent l’idée que la p53 de type sauvage a une fonction de suppression de tumeur dans la tumorigenèse du côlon, même dans le contexte d’un allèle mutant faux-sens Trp53. Lorsque toutes les tumeurs observées ont été comparées entre les souris AKP270/fl et AKPfl/fl, nous avons constaté que la proportion d’adénocarcinomes avec invasion de la sous-muqueuse ou plus profonde était plus élevée chez les souris AKP270/fl que chez les souris AKPfl/fl (36,9 % et 26,1 % pour les souris AKP270/fl et AKPfl/fl, respectivement ; Tableau 1, P = 0,0026), ce qui suggère un possible effet GOF modeste pour l’allèle R270H Trp53 dans l’augmentation de l’invasion des tissus. Cependant, l’augmentation modeste du potentiel invasif chez les souris AKP270/fl peut être compensée, car la charge tumorale moyenne par souris avait tendance à être plus élevée chez les souris AKPfl/fl que chez les souris AKP270/fl (28,0 contre 24,2 par souris, P = 0.054 ; tableau supplémentaire 1), et les souris AKPfl/fl et AKP270/fl n’ont pas présenté de différences significatives dans l’incidence des adénocarcinomes (7,3 vs 8,9 adénocarcinomes par souris, tableau supplémentaire 1 en haut à droite, P = 0,16). En outre, l’invasion de certaines tumeurs dans la musculeuse, la sous-séreuse ou la séreuse a été observée chez les souris AKP270/fl et AKPfl/fl (Fig. 1b et Tableau 1). Étant donné que seulement environ 30 % des tumeurs des souris AKP270/fl ou AKPfl/fl ont évolué vers des adénocarcinomes au cours de la période d’étude, des altérations somatiques supplémentaires en plus des défauts Apc, Kras et Trp53 sont probablement critiques dans la génération de carcinomes chez les souris AKP.

Histologie tumorale et métastases chez les souris AKP270/fl ou AKPfl/fl

Chacune des souris AKP270/fl et AKPfl/fl a développé un ou plusieurs adénocarcinomes au moment où les critères d’évaluation humaine ont été atteints. Chez les souris AKP270/fl, plus de 80 % des adénocarcinomes présentaient des caractéristiques bien à modérément différenciées, avec un bourgeonnement/une poussée tumorale au niveau du front d’invasion et une sécrétion occasionnelle de mucine (Fig. 2a, haut). Environ 15 à 20 % des adénocarcinomes AKP270/fl étaient peu différenciés, avec une morphologie solide de type trabéculaire (Fig. 2a, milieu). De rares carcinomes à cellules en anneau de signet ont été observés chez les souris AKP270/fl (Fig. 2a, bas). Chez les souris AKPfl/fl, environ 50 % des adénocarcinomes étaient bien à modérément différenciés avec sécrétion de mucine (Fig. 2b, haut) ; le reste était peu différencié (Fig. 2b, bas). Une forte coloration nucléaire et cytoplasmique de la β-caténine a été observée dans les tumeurs invasives AKP270/fl et AKPfl/fl (Fig. 2, milieu), ce qui est cohérent avec une signalisation Wnt défectueuse résultant de l’inactivation de l’Apc. Une forte coloration nucléaire de p53 a été observée dans les cellules tumorales AKP270/fl. Comme prévu, aucune coloration de p53 n’a été observée dans les cellules tumorales AKPfl/fl (Fig. 2, droite).

Types histologiques des adénocarcinomes du côlon provenant de souris mutantes p53. Des colorations H&E (panneaux de gauche) et des colorations immunohistochimiques pour la β-caténine (panneaux du milieu) et p53 (panneaux de droite) sont présentées pour des tumeurs du côlon indépendantes de types histologiques représentatifs provenant des souris AKP270/fl (a) et des souris AKPfl/fl (b). Les tumeurs ont été prélevées 3 mois après l’induction de la TAM. Barres d’échelle : 50 μm

A l’autopsie, des métastases ganglionnaires ont été trouvées chez 3 des 13 souris AKPfl/fl et 5 des 14 souris AKP270/fl (tableau 2). Parmi les trois souris AKPfl/fl qui présentaient chacune une métastase dans un ganglion lymphatique abdominal, une souris présentait également des métastases multiples au niveau du poumon et une autre souris présentait des métastases multiples au niveau du foie (tableau 2). Parmi les cinq souris AKP270/fl présentant chacune une métastase au niveau d’un ganglion lymphatique abdominal, une souris présentait des métastases multiples au niveau du poumon et une autre présentait des lésions métastatiques à la fois au niveau du poumon et du foie (tableau 2). Aucune lésion métastatique n’a été trouvée chez les souris AK ou AKP270/+ (tableau 2). Nos données indiquent que les CCR de souris avec des mutations faux sens ou nulles de Trp53 peuvent donner lieu à des métastases spontanées dans les ganglions lymphatiques et à distance à des fréquences comparables, ce qui plaide contre un effet GOF pour les mutations faux sens de Trp53 dans l’augmentation des métastases dans notre modèle de CCR de souris.

Transition épithélio-mésenchymateuse dans les CRC métastatiques avec Trp53 missens ou nul

Dans les dépôts métastatiques ganglionnaires individuels trouvés dans chacune des cinq souris différentes AKP270/fl, quatre lésions présentaient un adénocarcinome modérément différencié et une lésion était peu différenciée (Fig. 3a, b, panneaux supérieurs). Toutes les lésions métastatiques ganglionnaires modérément différenciées présentaient une forte coloration nucléaire de la β-caténine ainsi qu’une forte coloration membranaire de la E-cadhérine et une coloration absente de la vimentine (Fig. 3a), ce qui suggère la conservation des propriétés épithéliales dans les cellules métastatiques AKP270/fl qui ont conservé des caractéristiques modérément différenciées. Chez la seule souris AKP270/fl dont la métastase ganglionnaire présentait des caractéristiques peu différenciées, des lésions d’adénocarcinome à la morphologie peu différenciée ont également été trouvées dans le poumon, le foie et le cæcum (Fig. 3b et Fig. 1 supplémentaire). La lésion peu différenciée du cæcum et les lésions métastatiques présentaient une forte coloration nucléaire de la β-caténine, une perte d’expression de la E-cadhérine et une forte expression de la vimentine, ce qui correspond à des caractéristiques de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) (Fig. 3b et Fig. 1 supplémentaire). Toutes les lésions métastatiques chez les souris AKP270/fl se sont colorées positivement pour CDX2 (Fig. 2 supplémentaire), ce qui est cohérent avec leur origine épithéliale colique.

Les tumeurs métastatiques dérivées du côlon avec des mutations missens Trp53 peuvent subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Photomicrographies de sections colorées au H&E montrant les métastases des ganglions lymphatiques et des poumons trouvées chez deux souris AKP270/fl représentatives (a, b, panneaux supérieurs). Taches immunohistochimiques montrant une forte expression nucléaire de la β-caténine, une forte expression membranaire de l’E-cadhérine et une absence d’expression de la vimentine pour les lésions modérément différenciées trouvées chez une souris représentative (a, trois panneaux inférieurs). En revanche, les lésions peu différenciées trouvées chez une autre souris (b) présentent une forte expression nucléaire de la β-caténine, une perte d’expression de la E-cadhérine et une forte expression de la vimentine, ce qui indique que les lésions métastatiques trouvées chez cette souris ont subi une EMT (b, trois panneaux du bas). Les photomicrographies représentatives des sections colorées en H&E ont été montrées avec un grossissement à faible puissance pour l’orientation ; les sections sériées ont été soumises à une coloration immunohistochimique et la zone encadrée avec des colorations pour la β-caténine, la E-cadhérine et la vimentine ont été montrées avec un grossissement à forte puissance. Barres d’échelle : 20 μm pour toutes les images

Deux des trois métastases ganglionnaires provenant de souris AKPfl/fl porteuses de tumeurs étaient modérément différenciées et une était peu différenciée (Fig. 4a, b, panneaux supérieurs). La souris AKPfl/fl présentant des métastases hépatiques avait une métastase ganglionnaire modérément différenciée. Chez cette souris atteinte de métastases hépatiques, l’adénocarcinome primaire présumé du côlon index ainsi que les lésions métastatiques des ganglions lymphatiques et du foie présentaient tous une forte expression nucléaire de la β-caténine et une forte expression membranaire de la E-cadhérine (figure supplémentaire 3). Chez la seule souris AKPfl/fl présentant une métastase ganglionnaire peu différenciée, de multiples lésions de morphologie similaire ont également été trouvées dans son poumon (Fig. 4b). Des études immunohistochimiques ont montré que les lésions métastatiques pulmonaires et l’adénocarcinome primaire présumé dans le cæcum présentaient tous une forte expression nucléaire de la β-caténine, une expression réduite de la E-cadhérine et une forte expression de la vimentine, ce qui correspond à une EMT dans le cancer primaire et les cellules métastatiques (Fig. 4b). Les lésions métastatiques chez les souris AKPfl/fl étaient toutes CDX2-positives (Fig. 4 supplémentaire). Prises ensemble, nos données indiquent qu’il n’y a pas de différence significative dans les caractéristiques histologiques des lésions métastatiques survenant chez les souris AKP270/fl ou AKPfl/fl, et le sous-ensemble peu différencié des tumeurs primaires et des lésions métastatiques avec des mutations missens ou nulles de Trp53 peut manifester des caractéristiques EMT.

Les tumeurs métastatiques dérivées du côlon avec des mutations Trp53 nulles peuvent subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). a Photomicrographie d’une section colorée au H&E montrant une lésion tumorale modérément différenciée trouvée dans le ganglion lymphatique d’une souris AKPfl/fl représentative 2,5 mois après l’injection de TAM (panneau supérieur). Les colorations immunohistochimiques de cette lésion montrent une forte expression nucléaire de la β-caténine, une forte expression membranaire de la E-cadhérine et une absence d’expression de la vimentine (trois panneaux inférieurs). b Photomicrographies de coupes colorées au H&E montrant les lésions peu différenciées trouvées dans le cæcum, le ganglion lymphatique et le poumon d’une autre souris AKPfl/fl 4 mois après l’injection de TAM (panneau supérieur). Toutes ces lésions présentent une forte expression nucléaire de la β-caténine, une perte d’expression de la E-cadhérine et une forte expression de la vimentine, ce qui indique que les lésions primaires et métastatiques trouvées chez cette souris ont subi une EMT (trois panneaux inférieurs). Les photomicrographies représentatives des sections colorées en H&E ont été montrées avec un faible grossissement pour l’orientation ; les sections sériées ont été soumises à une coloration immunohistochimique et la zone encadrée avec des colorations pour la β-caténine, la E-cadhérine et la vimentine ont été montrées avec un fort grossissement. Barres d’échelle : 20 μm pour toutes les images

La stabilisation de la protéine p53 mutante faux-sens est associée à la perte de p53 de type sauvage et à la progression de la maladie

La majorité des tumeurs humaines présentant des mutations faux-sens de TP53 ont été signalées comme présentant une perte d’hétérozygotie (LOH) de TP53 , et une étude a indiqué que la LOH de TP53 est une condition préalable à la stabilisation de la p53 mutante faux-sens dans les sarcomes et les carcinomes mammaires de la souris . Nous avons évalué les profils de coloration de p53 à différents stades du développement tumoral chez les souris AKP270/+ après induction de la tumorigenèse par injection de TAM, car l’épithélium du côlon ciblé par Cre chez les souris AKP270/+ possède initialement un allèle Trp53 fonctionnel. Dans les polypes hyperplasiques des souris AKP270/+, où Kras est activé et où la LOH Apc n’a pas encore eu lieu, la coloration de p53 est non détectable (Fig. 5b, panneau HP), semblable à la coloration négative de p53 observée dans l’épithélium des souris de type sauvage (Fig. 5a), même si la protéine mutante faux-sens p53 R270H est exprimée de manière constitutionnelle dans les tissus du côlon des souris AKP270/+. Une certaine immunoréactivité de p53 a été clairement observée dans les adénomes (Fig. 5b, panneau adénome et Tableau 3, n = 185) et les carcinomes (Fig. 5c et Tableau 3, n = 28) apparus chez les souris AKP270/+. Parmi ces tumeurs, 94 % des adénomes et 43 % des carcinomes présentaient une faible coloration p53 (Fig. 5 et Tableau 3, 5-10 % de positivité), tandis que 6 % des adénomes et 57 % des carcinomes présentaient une forte coloration p53 (Fig. 5 et Tableau 3, >10 % de positivité, P < 0,0001). La majorité des tumeurs avec une forte coloration p53 ont montré une LOH p53, tandis que les tumeurs avec une faible coloration p53 ont conservé l’allèle de type sauvage Trp53 (Fig. 6). Nos résultats sont similaires à ceux observés dans des travaux récents sur l’expression de la protéine missense p53 dans les sarcomes de souris et les carcinomes mammaires. Nos données démontrent qu’à l’instar de la situation dans la tumorigenèse du côlon humain , l’expression d’une protéine p53 mutante faux sens stabilisée est étroitement corrélée à la perte de la fonction p53 de type sauvage et à la progression vers l’invasion.

La stabilisation de la protéine mutante p53R270H pendant la progression tumorale de l’hyperplasie au carcinome chez les souris AKP270/+. Coloration immunohistochimique de p53 dans un polype hyperplasique représentatif (HP, b, panneau de gauche), un adénome (b, panneau de droite) et trois carcinomes (c) survenant dans le cæcum de souris AKP270/+. Une section du cæcum d’une souris de type sauvage a été utilisée comme témoin (a). La coloration de p53 va d’une coloration non détectable dans les sections normales (a) et HP (b), à une coloration faible (<10% de positivité) dans l’adénome (b) et le carcinome 1 (c, panneau de gauche), et à une coloration forte dans les carcinomes 2 et 3 (>10% de positivité). Les lignes pointillées indiquent la musculature des muqueuses. Les flèches noires indiquent les glandes invasives avec une faible coloration de p53 ; les flèches rouges indiquent les glandes invasives avec une forte coloration de p53. Barres d’échelle : 50 μm

La stabilisation du mutant faux-sens p53R270H est corrélée à la perte d’hétérozygotie (LOH) de p53. a Génotypage des tumeurs du côlon (T2-T6) survenant chez les souris AKP270/+ 5 mois après l’induction du TAM. Une tumeur survenant chez une souris AKP270/fl (T1) et le tissu du côlon d’une souris de type sauvage (N) sont utilisés comme contrôle positif et négatif, respectivement. La présence de l’allèle sauvage Trp53 et de l’allèle mutant Trp53 recombiné (flox out) a été détectée par PCR. b-e La coloration immunohistochimique de p53 dans les tissus du côlon décrits en (a) montre une forte corrélation entre la stabilisation de p53 mutant (d, T2 et T3) et la perte d’hétérozygotie de p53, comparée à la faible coloration de p53 et à la présence de l’allèle sauvage Trp53 dans les tumeurs 4-6 (e). Les lignes pointillées indiquent la musculeuse. Barres d’échelle : 100 μm

Le profilage global de l’expression génique révèle peu de différences entre les cellules tumorales du côlon de souris ou d’humains hébergeant les allèles R270H/R273H mutant faux sens et Trp53/TP53 nul

Nous avons profilé l’expression génique dans les tissus d’adénocarcinome du côlon provenant de souris AKP270/fl (n = 6) ou AKPfl/fl (n = 6), en utilisant les puces Affymetrix Mouse ST 2.1 Arrays avec 24 562 jeux de sondes. Nous avons isolé l’ARN après microdissection par capture laser (LCM) des cellules cancéreuses d’une tumeur primaire invasive de chaque souris. Comme témoins, nous avons inclus des cellules épithéliales normales du côlon microdisséquées provenant de souris de type sauvage (n = 3). Nous avons adapté des modèles ANOVA à ces 15 échantillons avec des termes pour 3 moyennes. La comparaison des tissus tumoraux aux tissus normaux a donné plus de 2 400 ensembles de sondes avec P < 0,001 pour les tumeurs AKP270/fl et AKPfl/fl, mais la comparaison des deux types de tumeurs entre eux n’a donné que 30 ensembles de sondes, alors que nous nous attendons à 24,6 ensembles de sondes (24 562*0,001) par hasard. Ce dernier résultat indique que la plupart des 30 ensembles de sondes trouvés sont des faux positifs (tableau 4, partie supérieure), et qu’il y avait peu ou pas de différences significatives observables dans l’expression des gènes entre les tumeurs du côlon avec des mutations faux-sens de Trp53 et celles avec des mutations nulles de Trp53. Conformément à cette notion, nous avons constaté que les adénocarcinomes AKP270/fl et AKPfl/fl n’étaient pas distinguables dans les analyses en composantes principales (PC) de l’expression génique, bien que les deux groupes de tumeurs aient des profils d’expression génique qui sont clairement distincts de l’épithélium du côlon de type sauvage (figure supplémentaire. 5).

Nous avons également réalisé une analyse d’expression génique Affymetrix sur des organoïdes dérivés de tumeurs du côlon survenant chez des souris AKP270/fl (n = 3) ou AKPfl/fl (n = 2). Les organoïdes dérivés d’adénomes chez les souris Apcfl/fl (Cont 1, n = 3) ou de l’épithélium du côlon de type sauvage (Cont 2, n = 4) ont servi de témoins. Nous avons adapté un modèle ANOVA aux quatre groupes d’organoïdes. Nous avons trouvé 435 ensembles de sondes avec P < 0,001 pour les organoïdes AKPfl/fl et 609 ensembles de sondes pour les organoïdes AKP270/fl, par rapport aux organoïdes Apc-null (Cont 1, tableau 4). En outre, un plus grand nombre d’ensembles de sondes différentiellement exprimés ont été identifiés (960 pour AKPfl/fl et 1332 pour AKP270/fl, P < 0,001) lorsque les organoïdes AKPfl/fl ou AKP270/fl ont été comparés aux organoïdes de côlon normal (Cont2, tableau 4). Nous avons effectué un test d’enrichissement des voies sur les gènes qui étaient exprimés de manière différentielle dans les tumeurs et organoïdes AKPfl/fl et AKP270/fl par rapport à l’épithélium du côlon normal. Nous avons constaté qu’une variété de voies étaient significativement modifiées dans les cellules tumorales dérivées de p53 nul et mutant faux, avec des gènes impliqués dans le point de contrôle G2M, la croissance cellulaire, la réponse au stress et le métabolisme cellulaire comme les ensembles de gènes les plus significativement modifiés (tableau supplémentaire 2). Cependant, nous n’avons obtenu que 35 ensembles de sondes avec P < 0,001 pour la comparaison AKPfl/fl vs. AKP270/fl (tableau 4), où 24,6 étaient attendus par hasard, ce qui montre qu’il était difficile de trouver des différences d’expression génique entre les organoïdes avec des mutations Trp53 nulles et faux sens. Les parcelles PC ont montré que les échantillons AKPfl/fl et AKP270/fl se regroupaient toujours ensemble et étaient séparés des organoïdes dérivés d’adénomes mutants Apc (Cont1, figure supplémentaire 6) ou d’épithélium de côlon normal (Cont2, figure supplémentaire 6).

Pour vérifier s’il y avait des différences démontrables dans les profils d’expression génique entre les CRC humains avec des mutations missens et nulles de TP53, nous avons analysé les comptes normalisés transformés en log2 à partir des données RNA-seq pour les CRC dans The Cancer Genome Atlas (TCGA) , en comparant 9 tumeurs présentant des mutations missense du codon 273 de TP53 à 36 tumeurs présentant des mutations nulles (causées par un décalage de cadre, un site d’épissage et des mutations non sens, voir le tableau supplémentaire 3 pour plus de détails) par un test T à deux échantillons pour 20531 gènes. Nous avons trouvé seulement 244 gènes avec P < 0,01 et 30 gènes avec P < 0,001, ce qui est à peine plus que le nombre attendu par hasard (205 et 20,5, respectivement, Tableau 4). TP53 lui-même a donné la différence la plus significative dans l’expression des gènes, étant presque 5 fois plus faible en moyenne dans les tumeurs avec des mutations nulles par rapport aux mutations du codon 273 de TP53 (tableau supplémentaire 4, P = 2 × 10-10). Encore une fois, nous avons trouvé peu de séparation entre les deux ensembles de tumeurs dans l’analyse PC (figure supplémentaire 7). Conformément à la signature transcriptionnelle similaire, nous avons ajusté des modèles de risques proportionnels de Cox à 43 patients avec des données de survie, en utilisant l’âge, le stade et le statut TP53 dans le modèle, et nous n’avons pas trouvé d’association significative entre le résultat du patient et le statut de la mutation TP53 (mutation faux-sens R273 contre mutation nulle, tableau supplémentaire 5, P = 0,67 par le test de Wald). Il convient de mentionner qu’avec seulement 7 décès parmi ces patients, la puissance de détection des différences était assez faible. Enfin, nous avons examiné l’intersection des gènes donnant P < 0,05 dans l’un des trois ensembles de données décrits ci-dessus (c’est-à-dire les tumeurs du côlon humain et de la souris, les organoïdes du côlon de la souris) qui ont changé dans la même direction pour la comparaison entre Trp53/TP53 faux sens et mutation nulle. Dans le tableau supplémentaire 4, nous montrons les gènes qui ont donné P < 0,05 et des fold-changes d’au moins 1,3 dans deux des trois ensembles de données. Nous n’avons trouvé que Trp53/TP53 qui a changé dans la même direction dans les trois études (tableau supplémentaire 4 ; les statistiques détaillées pour chaque gène dans les trois ensembles de données sont disponibles dans notre série GEO publique). Dans l’ensemble, nos analyses de l’expression génique des CCR murins et humains indiquent que les tumeurs du côlon présentant des mutations R270/R273 faux sens ou nulles de Trp53/TP53 ont des profils d’expression génique très similaires, ce qui est cohérent avec l’absence de différences majeures dans les caractéristiques biologiques des tumeurs du côlon et les phénotypes apparaissant in vivo chez les souris AKP270/fl et AKPfl/fl.