La doxycycline est anti-inflammatoire et inhibe les cytokines et chimokines induites par l’exotoxine staphylococcique-.Induced Cytokines and Chemokines

La toxine 1 du syndrome du choc toxique staphylococcique (TSST-1) et les exotoxines structurellement apparentées sont des exotoxines bactériennes qui se lient directement aux molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité sur les cellules présentatrices d’antigènes (1, 5, 8, 18, 23) et activent les cellules T exprimant des éléments Vβ spécifiques (7). Ces toxines sont appelées superantigènes en raison de leur capacité à stimuler de manière polyclonale de grandes populations de cellules T (1, 4, 7, 14). Ainsi, les exotoxines staphylococciques (SE) sont de puissants activateurs du système immunitaire et provoquent diverses maladies chez l’homme, notamment des intoxications alimentaires, des chocs toxiques et des maladies auto-immunes (1, 2, 6, 12, 14, 22). Leurs interactions avec les cellules du système immunitaire entraînent une production massive de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires (1, 4, 15, 17). Les cytokines facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), interleukine-1 (IL-1) et interféron gamma (IFN-γ) sont des médiateurs clés du choc toxique induit par les superantigènes (1, 21). Le TNF-α et l’IL-1 ont tous deux de puissantes activités immunostimulantes et agissent en synergie avec l’IFN-γ pour renforcer les réactions immunitaires et favoriser les lésions tissulaires (16). Par conséquent, ces cytokines sont pathogènes à des concentrations élevées in vivo et sont responsables de la fièvre et du choc toxique induits par le SE (13, 14, 18, 19).

La doxycycline est un antibiotique à large spectre largement utilisé pour les infections causées par des micro-organismes à gram négatif et à gram positif. Elle agit comme un agent bactériostatique et est très efficace contre de nombreux micro-organismes, notamment Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis et Yersinia pestis. La doxycycline appartient à la famille des antibiotiques tétracyclines, dont les membres se sont révélés avoir d’autres actions biologiques indépendantes de leurs effets antimicrobiens (10). La doxycycline inhibe la métalloprotéinase 8 (MMP-8) et la MMP-9 de la matrice médiée par le phorbol-12-myristate-13-acétate dans les cellules endothéliales humaines (11). La doxycycline diminue également la dégradation de l’élastine et réduit l’activité des MMP dans un modèle de maladie anévrismale (3). Plus récemment, il a été démontré que la doxycycline inhibe la production d’IL-1β dans des cultures d’épithélium cornéen traitées par lipopolysaccharide dans une mesure comparable à celle obtenue par les corticostéroïdes (25). In vivo, la doxycycline a protégé des souris contre une endotoxémie létale en régulant à la baisse la sécrétion de cytokines et de nitrates dans le sang (20). Cette étude a été entreprise pour déterminer l’effet modulateur de la doxycycline sur l’activation des cellules T induite par le superantigène staphylococcique et la production de cytokines à partir des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC).

Les PBMC humaines ont été isolées par centrifugation en gradient de densité Ficoll-Hypaque du sang hépariné de donneurs humains normaux. Les PBMC (106/ml) ont été cultivées à 37°C dans des plaques à 24 puits contenant un milieu RPMI 1640 et 10% de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur. Les cellules ont été incubées avec SEB (200 ng/ml) ou TSST-1 (200 ng/ml) pendant 16 h, et les surnageants ont été récoltés et analysés pour la détection de IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α et MIP-1β. Les cytokines et les chimiokines ont été mesurées par un test immunoenzymatique avec des anticorps spécifiques des cytokines ou des chimiokines, conformément aux instructions du fabricant (15, 17). Des cytokines et des chimiokines humaines recombinantes (20 à 1 000 pg/ml) ont été utilisées comme étalons pour la calibration sur chaque plaque. La limite de détection de chaque test était de 20 pg/ml. Les données relatives aux cytokines et aux chimiokines ont été exprimées sous la forme d’une lecture moyenne ± l’écart type (ET) d’échantillons en double. La doxycycline, lorsqu’elle était présente, a été ajoutée simultanément à l’agent stimulant. La cytotoxicité a été mesurée par la libération de lactate déshydrogénase (LDH) du cytosol dans le surnageant de culture. La LDH a été quantifiée à l’aide d’un kit de test de cytotoxicité colorimétrique (Boehringer Mannheim) selon les instructions du fabricant. La quantité maximale de LDH libérable (100 %) a été obtenue en lysant les cellules avec 1 % de Triton X-100. La prolifération des cellules T a été testée avec des PBMC (105/puits), qui ont été placées en triplicat avec SEB ou TSST-1 (200 ng/ml), avec ou sans doxycycline, pendant 48 h à 37°C dans des plaques de microtitration à 96 puits. Les cellules ont été pulsées avec 1 μCi de thymidine (New England Nuclear, Boston, Mass.) par puits pendant les 5 dernières heures de culture, comme décrit précédemment (15). Les cellules ont été récoltées sur des filtres en fibre de verre, et la thymidine incorporée a été mesurée par scintillation liquide. Toutes les données ont été analysées pour les différences significatives par le test t de Student avec Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Les différences entre les groupes traités à la doxycycline et les groupes témoins non traités ont été considérées comme significatives si P était <0,05.

Sur la base du rapport selon lequel la doxycycline bloque l’IL-1 induite par le lipopolysaccharide dans les cellules épithéliales et prévient l’endotoxémie létale in vivo (20, 25), nous avons testé l’hypothèse selon laquelle cet antibiotique pourrait avoir des effets directs sur les cytokines induites par le SE. Comme le montre la figure 1, la doxycycline a inhibé de manière dose-dépendante la production des cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α et IFN-γ et des chimiokines MCP-1, MIP-1α et MIP-1β par les PBMC incubées avec le SEB. Une réduction dose-dépendante similaire des cytokines et des chimiokines par la doxycycline a également été observée pour les PBMC stimulées par le TSST-1 (données non présentées). L’effet inhibiteur de la doxycycline sur les cytokines et les chimiokines induites par la SEB ou le TSST-1 obtenues avec les PBMC de sept donneurs normaux est résumé dans la figure 2. La production de MCP-1 et d’IFN-γ a été complètement bloquée par 50 μM de doxycycline. Cette concentration de doxycycline a réduit les taux de IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP-1α et MIP-1β à 15 à 22 %, 37 à 41 %, 21 à 25 %, 10 à 15 % et 59 à 61 % de ceux des cellules non traitées, stimulées par SEB ou TSST, respectivement. Le TNF-β, lorsqu’il était présent, était également inhibé à 25 % de celui des cellules non traitées, stimulées par le SEB. La doxycycline n’était pas cytotoxique pour les PBMC à cette concentration, comme le montrent l’exclusion du bleu trypan et l’absence de libération de lactate déshydrogénase par les cellules traitées. Une inhibition complète de ces cytokines et chimiokines a été observée à des doses élevées de doxycycline (>0,1 mM). Une inhibition dose-réponse similaire par la doxycycline a été observée à des concentrations plus faibles de SEB (1 et 10 ng/ml) (données non présentées).

Parce que les superantigènes provoquent également la prolifération des cellules T, l’effet de la doxycycline sur la prolifération des cellules T induite par le SE a été étudié. La figure 3 montre que la doxycycline a inhibé la prolifération des cellules T stimulées par le SEB et le TSST-1 de manière dose-dépendante, atteignant 98 % d’inhibition à 0,05 mM.

Cette étude a démontré que la doxycycline inhibait efficacement la production de cytokines et de chimiokines médiée par les superantigènes par les PBMC humains in vitro. La prolifération des cellules T induite par les superantigènes staphylococciques a également été complètement supprimée. La régulation à la baisse des cytokines et des chimiokines pro-inflammatoires par la doxycycline dans les PBMC stimulées par le SEB et le TSST-1 suggère que la doxycycline peut affecter la pathophysiologie du choc toxique. Ces résultats prolongent les observations d’autres chercheurs sur les effets immunomodulateurs de la doxycycline en plus de ses activités antimicrobiennes.

De multiples mécanismes moléculaires, transcriptionnels et posttranscriptionnels, peuvent être impliqués dans les effets anti-inflammatoires de la doxycycline (11, 26). La suppression des cytokines pro-inflammatoires peut impliquer la régulation négative de la voie PKC par la doxycycline, comme le suggère une étude de ses effets sur la formation de granulomes (26). La dose inhibitrice de doxycycline rapportée (10 à 15 μM) qui réduit la collagénase, la gélatinase et d’autres métalloprotéinases in vitro (10, 11) est comparable à celle utilisée dans cette étude et est plusieurs fois supérieure à celle observée dans le sérum humain après une administration orale de 200 mg par jour (10, 24). Cependant, des études cliniques indiquent que cette dose était suffisante pour réduire les activités collagénase et gélatinase dans des extraits de cartilage ostéoarthritique humain ex vivo (24). Il a été démontré qu’une dose subantimicrobienne de doxycycline (20 mg deux fois par jour) inhibe l’activité collagénase du liquide gingival (9). En outre, des études in vivo de l’endotoxémie expérimentale ont également trouvé la doxycycline et d’autres tétracyclines efficaces pour réguler à la baisse les cytokines inflammatoires et prévenir le choc (20).

En conclusion, les résultats présentés ici indiquent que la doxycycline régule à la baisse les cytokines et les chimiokines pro-inflammatoires, suggérant ainsi son utilité potentielle pour traiter le choc toxique induit par les superantigènes. Dans un contexte clinique où l’hôte est exposé à de multiples agents biologiques, y compris à la fois des bactéries et des exotoxines bactériennes, l’utilisation de la doxycycline offre un avantage supplémentaire en fournissant à la fois des effets antimicrobiens et anti-inflammatoires.