Dans le système HC-FIA, les FNP fonctionnalisés par l’ADN de la sonde amplifient le signal de l’hybridation de l’ARN viral et de l’ADN de la sonde. Le principe de conception du biocapteur HC-FIA est présenté dans la figure 1.
a, Le principe du HC-FIA. b, Résultats représentatifs sur une bande de flux latéral. c, Le dispositif d’analyse par fluorescence. d, Une photographie du laboratoire de la valise portable, qui a une longueur de 55,5 cm, une largeur de 37 cm et une hauteur de 23 cm, avec un poids de 8,5 kg. e, Le processus de test de l’essai HC-FIA. Étape 1 : hybridation de l’acide nucléique dans un incubateur à température constante. Étape 2 : détermination de l’intensité des signaux de fluorescence sur la carte de test à l’aide du dispositif illustré en c. f, Distribution de la sonde dans le génome du SARS-CoV-2.
Conception et fonctionnement du test HC-FIA
Les anticorps monoclonaux murins S9.6 sont préfixés sur la ligne de test (T) de la bandelette à flux latéral, et la ligne de contrôle (C) est recouverte d’anticorps polyclonaux IgG de chèvre anti-lapin (Fig. 1a). Les FNP marqués avec les anticorps S9.6 et les IgG de lapin sont placés dans le tube de réaction. Au début du processus de détection, le SARS-CoV-2 présent dans l’échantillon d’écouvillon de gorge ou d’expectoration est lysé et libéré, et l’ARN libéré s’hybride avec la sonde ADN spécifique du SARS-CoV-2. L’hybride ARN-ADN résultant est capturé par les anticorps S9.6 marqués au FNP, et le complexe s’écoule le long du tampon d’échantillonnage et de la membrane de nitrocellulose vers le papier absorbant sous l’effet des forces capillaires. En passant par la zone T, le complexe est capturé par les anticorps S9.6, générant progressivement un signal fluorescent. Dans la zone C, les IgG de lapin marquées au FNP sont capturées par les IgG anti-lapin. La présence ou l’absence de l’ARN cible du SRAS-CoV-2 est basée sur une valeur seuil de l’intensité de la fluorescence (Fig. 1b,c). La figure 1d montre un laboratoire portable de type valise qui a la capacité de fournir des résultats qualitatifs en moins d’une heure après les deux étapes suivantes : l’hybridation et l’analyse par immunofluorescence (figure 1e).
Nous avons utilisé ici le rapport entre le signal de fluorescence du test et le signal de fluorescence du contrôle (T/C) sur la bande de flux latéral, de sorte que l’influence de toute fluorescence de fond de la carte de test soit minimisée. En mesurant le rapport T/C d’échantillons de prélèvements de gorge provenant de 211 personnes en bonne santé, nous avons constaté que le rapport T/C de fond moyen était de 49,95, avec un écart-type de 17,16 (figure supplémentaire 1a). La courbe ROC (receiver operating characteristic) et l’aire sous la courbe (AUC) ont été utilisées pour déterminer la valeur seuil et évaluer la précision diagnostique du test HC-FIA sur la base de la sensibilité et de la spécificité à différents seuils. Nous avons déterminé une courbe ROC avec une AUC de 0,999 avec un intervalle de confiance (IC) de 95 % de 0,997-1,000 (figure supplémentaire 1b) en utilisant des échantillons de prélèvement de gorge provenant de 100 cas de COVID-19 cliniquement confirmés et exclus. La valeur seuil qui a obtenu la sensibilité et la spécificité les plus élevées a été déterminée comme étant de 102,07, correspondant au point d’indice de Youden de 0,980. Par ailleurs, une valeur seuil correspondant à deux fois la valeur du fond négatif (ici, 49,95 × 2 = 99,90) est généralement utilisée comme valeur seuil dans les tests immunologiques. Pour des raisons de commodité, nous avons choisi une valeur seuil T/C de 100,00.
Développement du test HC-FIA
L’optimisation des sondes ADN pour la séquence ARN cible du SRAS-CoV-2 est essentielle pour améliorer l’efficacité du test. Une liste de toutes les séquences de sondes ADN que nous avons conçues est fournie dans le tableau supplémentaire 1. Le génome du SARS-CoV-2 comprend environ 30 000 bases, dont un nombre variable (6-11) de cadres de lecture ouverts (ORF). Le premier ORF représente environ 67 % de l’ensemble du génome et code pour 16 protéines non structurelles ainsi que pour des protéines auxiliaires et des protéines structurelles. Les quatre principales protéines structurelles sont la glycoprotéine de pointe (S), la petite protéine d’enveloppe (E), la protéine de matrice (M) et la protéine de nucléocapside (N)15,16. La plupart des tests de détection des acides nucléiques du SRAS-CoV-2 utilisent les trois régions conservées suivantes du génome viral : ORF1ab, dans lequel se trouve le gène de la polymérase ARN-dépendante (rdrp)15, et les régions qui codent N et E.
Nous avons commencé par récupérer la séquence du génome ARN du SRAS-CoV-2 dans la GenBank du National Center for Biotechnology Information (NCBI) (numéros d’accession, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 et NC_045512.1). Une analyse détaillée des autres séquences publiées pour le génome du SRAS-CoV-2 n’a révélé aucune variation notable dans ces régions. À l’aide du logiciel de conception Primer Premier 5.0, nous avons conçu trois sondes pour chacune des trois régions : CoV01 et CoV04, situées dans la région recommandée pour la détection des ORF1ab et N, respectivement ; et CoV08, dans la même région que E17. Les positions génomiques des sites de liaison des sondes dans la séquence du génome de référence (NC_045512.2) sont indiquées sur la figure 1f.
Un alignement de séquences a été effectué entre les sondes ADN conçues et les séquences du génome humain et des génomes de virus, de bactéries, de mycoplasmes, de chlamydia et d’autres agents pathogènes courants. Les sondes ne correspondaient qu’à la séquence génomique du SRAS-CoV-2, et nous n’avons trouvé aucune homologie avec l’ADN génomique humain. Des pseudovirus portant différentes régions du gène cible, construits en utilisant des lentivirus comme vecteurs, ont été utilisés comme témoins positifs. Les séquences du gène cible des pseudovirus utilisés sont indiquées dans le tableau supplémentaire 2. P1 était positif pour la région N du SARS-CoV-2, P2 pour la région E du SARS-CoV-2 et P3 pour la région ORF1ab du SARS-CoV-2. La concentration des trois témoins positifs était de 3 000 unités de transduction (UT) ml-1, ce qui indique qu’il y avait 3 000 particules virales infectieuses par ml. Une solution saline physiologique, de l’eau purifiée et des échantillons d’écouvillons pharyngés positifs pour d’autres agents pathogènes courants ont été utilisés comme témoins négatifs de N1-N17. Une liste d’informations sur les références positives et négatives utilisées dans l’étude est fournie dans le tableau supplémentaire 3. Les résultats des tests sont présentés dans les tableaux supplémentaires 4-6. Pour la région ORF1ab, les sondes CoV01 et CoV03 ont été sélectionnées ; pour la région E, la sonde CoV08 a été sélectionnée ; et pour la région N, les sondes CoV04 et CoV06 se sont liées préférentiellement à l’ARN cible. Les sondes d’ADN sélectionnées ont ensuite été optimisées par combinaison (tableau supplémentaire 7), chaque groupe de sondes ciblant simultanément les trois segments. Les résultats du test HC-FIA présentés dans le tableau supplémentaire 8 montrent que la combinaison des sondes Cov01, Cov04 et Cov08 (groupe 2) a permis de distinguer tous les échantillons de contrôle positifs des contrôles négatifs, et de détecter les échantillons positifs avec un faible titre viral (1 000 TU ml-1 ; tableau supplémentaire 3, L1-L3) avec un taux de positivité supérieur à 95 %. Le groupe 2 a donc été sélectionné comme la combinaison finale. À ce jour, 13 411 séquences nucléotidiques du SRAS-CoV-2 ont été publiées sur le NCBI. L’alignement des trois sondes avec la région cible correspondante dans les 13 411 séquences téléchargées a révélé que les régions cibles des sondes étaient suffisamment conservées pour donner une similarité de 100 %.
Nous avons également optimisé les conditions d’essai du test, en particulier le temps d’incubation pour l’hybridation et le temps de lecture de la bandelette. La performance du test pour des temps d’incubation de 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min et 60 min à 56 °C est présentée dans le tableau supplémentaire 9. Il convient de noter que 20 minutes étaient suffisantes pour que les sondes d’ADN s’hybrident avec la région cible, comme le montre le taux de 100 % de détection positive des échantillons d’écouvillon de gorge et d’expectoration à faible titre viral (1 000 UT ml-1 ; tableau supplémentaire 3, L1-L3). Lorsque le temps d’incubation a été porté à 50 ou 60 minutes, la réaction n’était pas aussi stable, car le taux de positivité des échantillons de référence L1-L3 a diminué. En tenant compte de l’efficacité de la détection et de l’exigence d’inactivation du virus, nous avons choisi 30 min comme temps d’incubation pour l’hybridation à 56 °C. Nous avons également évalué le temps de lecture de la bandelette pour les valeurs 10 min, 12 min, 15 min et 18 min (tableau supplémentaire 10). Les résultats indiquent que 12 min ou plus ont conduit à la détection correcte des échantillons de référence positifs et négatifs. Cependant, le coefficient de variation (CV) était inférieur à 10 % pour la détection des échantillons positifs avec un faible titre viral uniquement en utilisant un temps de lecture de 15 min. Nous avons donc choisi un temps de lecture de 15 min.
Le thiocyanate de guanidinium et le chlorure de guanidine – les dénaturants protéiques les plus utilisés pour l’extraction des acides nucléiques – ont été comparés comme supports de transport pour la conservation des échantillons. Le thiocyanate de guanidinium a donné de meilleurs résultats en matière de discrimination entre les échantillons positifs et négatifs, avec un CV relativement faible pour les échantillons à faible titre viral. En fait, le thiocyanate de guanidinium à une concentration aussi élevée que 6 mol l-1 a montré d’excellentes propriétés antivirales18. Nous avons choisi le thiocyanate de guanidinium à une concentration de 5 mol l-1 comme dénaturant protéique pour l’inactivation virale dans le milieu de transport.
Spécificité du test HC-FIA
Après avoir optimisé les séquences de sonde et les conditions de réaction, nous avons examiné la spécificité du test HC-FIA pour la détection du SARS-CoV-2. Les contrôles positifs comprenaient des pseudovirus (échantillons P1-P3) avec des gènes cibles, et cinq échantillons cliniques de prélèvements de gorge (échantillons P4-P8), confirmés à l’aide d’un kit de détection d’acide nucléique basé sur la RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Les contrôles négatifs, constitués d’échantillons de prélèvements de gorge, ont été confirmés négatifs pour le SRAS-CoV-2, et positifs pour la grippe A, la grippe B, le virus respiratoire syncytial, la chlamydia pneumoniae, l’adénovirus ou d’autres agents pathogènes (échantillons N5-N17), ou pseudovirus-positif pour la région N du MERS (échantillon N18) ou du SRAS (échantillon N19). Une liste de tous les échantillons est fournie dans le tableau supplémentaire 3. Une liste des résultats de détection de 8 échantillons de référence positifs et de 15 échantillons de référence négatifs est fournie dans le tableau supplémentaire 11.
Nous avons cherché à savoir s’il existait une réactivité croisée entre le SRAS-CoV-2 et 55 agents pathogènes courants responsables de maladies respiratoires. La source et les informations quantitatives de chaque micro-organisme pathogène sont fournies dans le jeu de données supplémentaires 1. Le titre initial du virus a été déterminé comme étant de 106 unités formatrices de plaques par ml à l’aide d’un test de plaques. Pour les échantillons interférents de bactéries, de mycoplasmes et de chlamydia, le niveau de concentration était de 107 unités formant des colonies par ml. En outre, l’ADN génomique humain a été extrait et quantifié à 90-105 µg ml-1 à partir de trois échantillons de sang total. L’essai HC-FIA a montré une excellente spécificité pour le SRAS-CoV-2, sans réactivité croisée évidente avec tous les autres échantillons pathogènes et l’ADN génomique humain (ensemble de données supplémentaires 1).
Comme l’anticorps monoclonal S9.6 se lie également aux duplex ARN-ARN19, en particulier ceux riches en UA20, nous avons conçu des séquences d’ARN double brin avec des fractions variables d’UA. Des informations détaillées sur les séquences sont fournies dans le tableau supplémentaire 12. Comme le montre le tableau supplémentaire 13, quelle que soit la teneur en AU, l’essai HC-FIA n’a pas présenté de signal positif détectable pour l’ARN double brin, ce qui indique qu’il existe une faible affinité de liaison entre l’anticorps S9.6 et l’ARN double brin dans les conditions de l’essai. Nous avons également cherché à savoir si la présence d’ARN double brin affectait les performances du test dans la détection d’échantillons cliniques d’écouvillons de gorge ou de crachats. Nous avons utilisé 2 échantillons positifs de prélèvements de gorge, 2 échantillons positifs d’expectoration, 10 échantillons négatifs de prélèvements de gorge et 5 échantillons négatifs d’expectoration. Nous avons mesuré les rapports T/C par rapport aux valeurs T/C du test sans interférence, et nous avons constaté que les rapports se situaient entre 0,9 et 1,1 (ensemble de données supplémentaires 1). Cela indique que la présence d’ARN double brin, indépendamment de la teneur en UA, n’affecte pas de manière significative la performance du test HC-FIA.
Sensibilité et précision du test HC-FIA
Nous avons dilué en série les échantillons de pseudovirus contenant trois sections de gènes cibles à des titres de 5 000, 2 500, 1 000, 800, 500, 250 et 100 UT ml-1, et calculé les valeurs T/C moyennes pour 20 tests parallèles. La figure 2a montre que les valeurs de la limite de détection (LOD) des pseudovirus positifs pour les régions N, E ou ORF1ab du SRAS-CoV-2 étaient aussi basses que 1 000 UTM ml-1, avec un taux de positivité supérieur à 95 %. Lorsque les titres des échantillons de pseudovirus ont atteint 108 TU ml-1, aucun effet de crochet notable n’a été observé (figure supplémentaire 2). La gamme linéaire de l’essai correspond à des titres compris entre 103 et 106 ou 107 TU ml-1.
Les axes verticaux montrent le rapport fluorescence-intensité (T/C) du signal de test (T) et du signal de contrôle (C). Pour chaque concentration, 20 tests ont été réalisés en parallèle. Le LOD a été déterminé comme la concentration à laquelle le taux de positivité était supérieur ou égal à 95 %. a, rapports T/C pour des échantillons de pseudovirus dilués en série et positifs pour les régions N, E et ORF1ab du SRAS-CoV-2. b, rapports T/C pour des échantillons de prélèvements de gorge dilués en série provenant de trois patients gravement malades. Les données sont la moyenne ± l’écart-type
Les échantillons d’écouvillon de gorge de trois patients gravement malades – qui ont été déterminés comme étant positifs pour le SARS-CoV-2 en utilisant la RT-qPCR, et les charges virales ont été quantifiées en utilisant la PCR numérique – ont été mélangés avec des échantillons d’écouvillon de gorge négatifs pour préparer des dilutions en série de 2 000, 1 000, 500, 400 et 250 copies par ml. Comme le montre la figure 2b, le LOD était de 500 copies par ml avec un taux de positivité supérieur à 95 %. Des échantillons de frottis de gorge cliniques présentant des valeurs T/C proches de la valeur critique (100) pour la positivité (échantillons présentant 512, 489 et 497 copies par ml de la région ORF1ab, selon la PCR numérique) ont été utilisés pour vérifier la LD (tests effectués 20 fois en parallèle). Les taux de positivité de ces échantillons étaient supérieurs à 95 % (tableaux supplémentaires 14-16).
Pour évaluer la précision du kit HC-FIA, des tests parallèles ont été effectués 20 fois pour chaque échantillon clinique de gorge pendant cinq jours consécutifs. Les échantillons cliniques représentatifs choisis étaient un échantillon positif (1 348 copies par ml de la région ORF1ab), un échantillon provenant d’un individu gravement malade (critique ; 512 copies par ml) et un échantillon négatif (0 copie par ml). Les valeurs moyennes de T/C des trois lots dans la détection de l’échantillon positif étaient les suivantes : 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94 %) et 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73 %), respectivement, contre 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) et 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) pour l’échantillon critique, et avec 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) et 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) pour l’échantillon négatif. Les valeurs du CV d’un lot à l’autre étaient de 3,89 %, 4,66 % et 6,74 %. Ainsi, le test a montré une bonne précision et une bonne reproductibilité pour la détection du SARS-CoV-2.
Robustesse du test HC-FIA
Pour connaître la robustesse du HC-FIA, nous avons évalué les effets des substances interférentes endogènes (telles que l’hémoglobine et la mucine) et des substances interférentes exogènes (en particulier, les médicaments cliniques couramment utilisés dans le traitement des patients atteints d’infections respiratoires, y compris les médicaments antiviraux, les antibiotiques et les hormones). Pour cette expérience, nous avons utilisé 18 échantillons de prélèvements de gorge cliniques, dont six échantillons critiques (500-530 copies par ml pour la région ORF1ab, selon la PCR numérique), six échantillons négatifs et six échantillons positifs. Les résultats ont également été enregistrés sous la forme du rapport des valeurs T/C (échantillons d’interférence par rapport aux échantillons de contrôle). Dans les échantillons d’interférence préparés, les concentrations d’hémoglobine étaient de 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 et 2,0 g l-1, et les concentrations de mucine étaient de 5 g l-1, 10 g l-1 et 20 g l-1. Les concentrations de médicaments des échantillons d’interférence exogène (tableaux supplémentaires 17-19) étaient beaucoup plus élevées que leurs concentrations plasmatiques maximales in vivo. Comme prévu, tous les rapports T/C étaient compris entre 0,9 et 1,1 (ensemble de données supplémentaires 2), ce qui indique que le test HC-FIA est robuste aux interférences.
Évaluation clinique du kit de test HC-FIA
Pour évaluer davantage la performance du test HC-FIA, un essai clinique randomisé en double aveugle a été réalisé en comparant le test avec la RT-qPCR (kit de détection du SRAS-CoV-2 produit par Shanghai ZJ Bio-Tech, et approuvé par la NMPA) ou avec les résultats du diagnostic clinique dans trois institutions médicales indépendantes. Le kit de test HC-FIA utilisé dans l’évaluation clinique contenait des cartes de test, un tampon de lyse, une solution de conservation des échantillons, des contrôles positifs et négatifs, et un tube de réaction avec des sondes ADN et des anticorps marqués. Les résultats du diagnostic clinique des cas confirmés ou exclus de COVID-19, fournis par les hôpitaux désignés, étaient basés sur les images de tomographie assistée par ordinateur et sur les manifestations cliniques des patients, conformément aux directives du « Protocole de diagnostic et de traitement de la pneumonie à nouveau coronavirus (version d’essai 6.0) » de la Chine. Au total, 734 échantillons (593 écouvillons de gorge et 141 crachats) fournis par 670 personnes ont été testés en parallèle. Les données brutes des essais cliniques sont fournies dans le jeu de données supplémentaires 3. Le kit de détection RT-qPCR que nous avons utilisé a été conçu comme un système à trois cibles (ORF, N et E), et nous avons suivi le principe du test-retest pour distinguer les échantillons positifs des échantillons négatifs. En plus des quatre tests d’échec causés par un standard interne invalide, huit tests-retests ont été effectués : un parce qu’un seul gène cible rdrp était positif, et sept parce que seuls les gènes N et E étaient positifs. Dans ces cas, les résultats négatifs précédents ont été exclus.
Sur les 670 patients inscrits à l’essai, 313 étaient des hommes (46,72 %) et 357 des femmes (53,28 %). Comme le montre la figure supplémentaire 3, la répartition par âge de la population inscrite est similaire à celle de l’infection par le SRAS-CoV-221. Le taux de visite et le taux de diagnostic étaient également équilibrés. Les résultats des kits de test HC-FIA sont présentés dans la Fig. 3, qui montre des photographies de résultats typiques sous une source de lumière fluorescente et la matrice de gradient de couleur correspondante après normalisation de la lecture. La matrice de couleur de gradient dans la figure 4 supplémentaire montre les lectures de fluorescence normalisées de 734 échantillons cliniques (ensemble de données supplémentaires 3).
Photographies de résultats typiques sous une source de lumière fluorescente, et les lectures de fluorescence correspondantes sous forme de matrice à gradient de couleur, normalisée à la valeur de lecture maximale. Le groupe E est composé uniquement de résultats négatifs au COVID-19. La ligne horizontale sur la barre de couleur indique la valeur de coupure. Une matrice de gradient de couleur pour les lectures de fluorescence de 734 échantillons cliniques est fournie dans la figure supplémentaire 4, et les données numériques correspondantes dans le jeu de données supplémentaires 3.
Pour 621 cas, les résultats de HC-FIA et les diagnostics cliniques étaient cohérents (210 cas confirmés et 411 cas exclus ; tableau 1) ; 49 cas (27 confirmés et 22 exclus par diagnostic clinique) étaient incompatibles avec les résultats de HC-FIA. Pour 730 échantillons, les résultats du test HC-FIA étaient cohérents avec la RT-qPCR (249 positifs et 481 négatifs ; tableau 1). Quatre échantillons qui étaient négatifs sur la base de la RT-qPCR étaient positifs en utilisant HC-FIA. Trois de ces échantillons provenaient de patients qui avaient été diagnostiqués cliniquement comme exclus du COVID-19, indiquant que le test HC-FIA avait donné des résultats faussement positifs. L’échantillon restant correspondait à un cas confirmé par le diagnostic clinique, en accord avec le test HC-FIA.
Le Kappa de Cohen (κ), qui est une mesure fréquemment utilisée de la fiabilité de l’accord entre les variables catégorielles, est une mesure plus robuste par rapport au simple pourcentage d’accord entre les variables, car κ prend en compte les accords qui se produisent par hasard, en particulier dans les ensembles de données déséquilibrés. Nous avons considéré qu’une valeur κ supérieure à 0,75 indique un niveau élevé de concordance (une concordance parfaite correspond à un κ = 1). Comme le montre le tableau 2, les résultats du test HC-FIA étaient en accord élevé avec le diagnostic clinique (κ = 0,8393) et avec la RT-qPCR (κ > 0,98, quel que soit le type d’échantillon).
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