Méthodes, techniques et protocoles d’immunocytochimie

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Pour assurer le libre accès de l’anticorps à son antigène, les cellules doivent être fixées et perméabilisées. En général, les forces et les temps de fixation sont considérablement plus courts pour les cellules que sur les sections de tissus plus épaisses et structurellement complexes. Pour l’immunocytochimie, la préparation de l’échantillon consiste essentiellement à fixer les cellules cibles sur la lame. Une fixation parfaite doit immobiliser les antigènes, tout en conservant l’architecture cellulaire et subcellulaire authentique et en permettant un accès sans entrave des anticorps à toutes les cellules et à tous les compartiments subcellulaires. Une large gamme de fixateurs est couramment utilisée, et le choix de la bonne méthode dépendra de la nature de l’antigène examiné et des propriétés de l’anticorps utilisé. Les méthodes de fixation se divisent généralement en deux catégories : les solvants organiques et les réactifs de réticulation. Les solvants organiques tels que les alcools et l’acétone éliminent les lipides et déshydratent les cellules, tout en précipitant les protéines sur l’architecture cellulaire. Les réactifs de réticulation (tels que le paraformaldéhyde) forment des ponts intermoléculaires, normalement par le biais de groupes amino libres, créant ainsi un réseau d’antigènes liés. Les réticulants préservent mieux la structure cellulaire que les solvants organiques, mais peuvent réduire l’antigénicité de certains composants cellulaires et nécessitent l’ajout d’une étape de perméabilisation pour permettre l’accès de l’anticorps à l’échantillon. La fixation par les deux méthodes peut dénaturer les antigènes protéiques, et pour cette raison, les anticorps préparés contre les protéines dénaturées peuvent être plus utiles pour la coloration des cellules. Différentes méthodes de fixation sont décrites. La méthode de fixation appropriée doit être choisie en fonction de l’application concernée.

1. Fixation à l’acétone

  • Fixer les cellules dans de l’acétone à -20°C pendant 5-10 minutes.

  • Aucune étape de perméabilisation n’est nécessaire après la fixation à l’acétone.

2. Fixation au méthanol

  • Fixer les cellules dans du méthanol à -20°C pendant 5-10 minutes.

  • Aucune étape de perméabilisation n’est nécessaire après la fixation au méthanol.

3. Fixation à l’éthanol

  • Fixez les cellules dans de l’éthanol refroidi à 95%, 5% d’acide acétique glacial pendant 5-10 minutes.

4. fixation au méthanol-acétone

  • Fixer dans du méthanol refroidi, 10 minutes à -20 °C.

  • Eliminer l’excès de méthanol.

  • Perméabiliser avec de l’acétone refroidi pendant 1 minute à -20 °C.

5. Fixation par mélange méthanol-acétone

  • Mélange 1:1 de méthanol et d’acétone.

  • Faire le mélange frais et fixer les cellules à -20 C pendant 5-10 minutes.

6. Fixation par mélange de méthanol et d’éthanol

  • Mélange de méthanol et d’éthanol 1:1.

  • Faire le mélange frais et fixer les cellules à -20 C pendant 5-10 minutes.

7. fixation au formol

  • Fixer les cellules dans du formol tamponné neutre à 10% pendant 5-10 minutes.

  • Rincer brièvement avec du PBS.

  • Perméabiliser avec 0,5% de Triton X-100 pendant 10 minutes.

8. Fixation au paraformaldéhyde-Triton

  • Fixer dans 3-4% de paraformaldéhyde pendant 10-20 minutes.

  • Rincer brièvement avec du PBS.

  • Perméabiliser avec du Triton X-100 à 0,5% pendant 10 minutes.

9. Fixation au paraformaldéhyde et au méthanol

  • Fixation dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 10 à 20 minutes.

  • Rincer brièvement avec du PBS.

  • Perméabiliser avec du méthanol refroidi pendant 5 à 10 minutes à -20 °C.

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