Identification moléculaire d’espèces de Mycobacterium d’importance sanitaire et vétérinaire provenant de bovins de l’État du Sud du Mexique

Abstract

Le genre Mycobacterium cause une variété de maladies zoonotiques. L’exemple le plus connu est la tuberculose zoonotique due à M. bovis. On connaît beaucoup moins les « mycobactéries non tuberculeuses (MNT) », qui sont également associées à des infections chez l’homme. La norme mexicaine NOM-ZOO-031-1995 réglemente la présence de M. bovis chez les bovins ; cependant, il n’existe aucune réglementation pour les espèces NTM. L’objectif de cette étude était d’isoler et d’identifier les espèces de mycobactéries non tuberculeuses des bovins des troupeaux locaux de la région sud de l’État de Mexico par l’identification et la détection du marqueur moléculaire de 100 pb dans le gène de l’ARNr 23S avec séquençage ultérieur du gène de l’ARNr 16S. Des échantillons de lait (35) et d’exsudat nasal (68) ont été collectés. Parmi les 108 souches isolées, 39 ont été sélectionnées pour être identifiées. Treize souches isolées des exsudats nasaux ont amplifié le marqueur moléculaire de 100 pb et ont été identifiées comme étant M. neoaurum (six souches), M. parafortuitum (quatre souches), M. moriokaense (deux souches) et M. confluentis (une souche). A l’exception de M. parafortuitum, les autres espèces identifiées constituent une préoccupation de santé publique et vétérinaire car elles sont pathogènes pour les humains, en particulier ceux qui ont des conditions médicales sous-jacentes.

1. Introduction

Le genre Mycobacterium provoque une grande variété de maladies zoonotiques. L’exemple le plus connu est la tuberculose zoonotique due à M. bovis, dont le bétail est le principal réservoir. M. bovis fait partie du « complexe tuberculeux », qui comprend également les espèces M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae et M. microti .

Dans le groupe des mycobactéries se trouvent les « mycobactéries non tuberculeuses (MNT) », qui sont également associées à des infections chez l’homme. Les MNT sont présentes dans diverses sources environnementales telles que le sol, l’eau, la végétation, les animaux, les produits laitiers et les matières fécales et peuvent être transmises par inadvertance par inhalation, ingestion ou pénétration cutanée .

La norme mexicaine NOM-ZOO-031-1995 réglemente la présence de M. bovis chez les bovins afin de contrôler et d’éradiquer la tuberculose bovine (TBB) ; cependant, aucune réglementation n’existe pour les espèces MNT. Le diagnostic officiel de la tuberculose bovine due à la présence de M. bovis au niveau du terrain est basé sur le test intradermique utilisant un dérivé protéique purifié (tuberculine). Bien qu’utilisé depuis plusieurs années, ce test n’offre pas une bonne sensibilité et spécificité. Environ 20 % des animaux atteints de tuberculose ne réagissent pas au test , et la présence d’autres espèces mycobactériennes, qu’il s’agisse du complexe tuberculosis ou des espèces NTM, provoque des interférences qui entraînent des diagnostics faussement positifs et faussement négatifs.

Bien que le Mexique dispose d’une norme réglementaire, une prévalence de la BTB supérieure à 2 % est signalée dans certaines régions . Compte tenu de la faible spécificité et sensibilité du test tuberculinique, la présence réelle de M. bovis est probablement plus faible et le taux d’infection des bovins par d’autres mycobactéries est probablement plus élevé, respectivement. Ainsi, les éleveurs de bovins, les vétérinaires, les techniciens et les employés travaillant dans l’industrie de l’élevage pourraient être exposés professionnellement aux infections par M. bovis et NTM. On sait très peu de choses sur l’exposition professionnelle aux zoonoses dues aux espèces NTM car l’identification de ces espèces était une tâche assez difficile avant le développement des techniques d’identification basées sur la biologie moléculaire.

Actuellement, les techniques de biologie moléculaire les plus utilisées pour le diagnostic des maladies causées par les mycobactéries sont le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP) pour le diagnostic de M. tuberculosis , le spoligotypage pour le diagnostic de M. bovis , et la détection d’une « insertion spécifique » de 100 paires de bases (pb) située sur le gène de l’ARNr 23S caractéristique des bactéries Gram-positives à forte teneur en guanine-cytosine (HGC), qui est considérée comme un marqueur moléculaire pour ce groupe de bactéries , suivie d’une analyse de séquence du gène de l’ARNr 16S pour l’identification des bactéries au niveau des espèces .

Parmi les espèces de MNT identifiées par les techniques susmentionnées, on trouve M. balnei, M. marinum, et M. platypoecilus, qui ont causé des lésions cutanées superficielles et profondes ; M. kansasii des lésions pulmonaires ; M. simiae des infections généralisées ; M. scrofulaceum dans des infections de la peau et des organes internes ; M. szulgai associé à des infections pulmonaires, des ostéomyélites, des ténosynovites et des lymphadénites ; M. ulcerans associé à des granulomes sous-cutanés ; M. fortuitum et M. chelonae associés à une vasculite, une endocardite, une ostéomyélite, une médiastinite, une méningite, une kératite et une hépatite ; M. abscessus, associé à des lésions érythémateuses qui ont évolué vers des nodules ulcérés ; et d’autres espèces.

Le plus grand pourcentage de l’inventaire de l’État pour les têtes de bétail dans l’État de Mexico au Mexique est concentré dans la région sud, et l’une des principales activités économiques est l’élevage de bovins . Le règlement mexicain pour le contrôle des bovins NOM-ZOO-031-1995 se concentre uniquement sur le test à la tuberculine pour le diagnostic de M. bovis. On sait peu de choses sur la présence de MNT dans le bétail de la région. Étant donné la possibilité d’identifier les espèces d’actinobactéries par la détection du marqueur moléculaire de 100 paires de bases sur le gène de l’ARNr 23S et le séquençage ultérieur du gène de l’ARNr 16S, il est possible d’identifier les espèces de MNT susmentionnées.

L’objectif de la présente étude était d’isoler et d’identifier les espèces de MNT chez les bovins de la région sud de l’État de Mexico. Les espèces de Mycobacterium ont été isolées à partir d’échantillons d’exsudat nasal et de lait bovin et identifiées par la détection du marqueur moléculaire de 100 paires de bases dans le gène de l’ARNr 23S avec un séquençage ultérieur du gène de l’ARNr 16S.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Échantillonnage

Un échantillonnage a été effectué sur la base de la distribution spatiale des troupeaux positifs pour la tuberculose bovine dans l’État du Mexique réalisée par Zaragoza et al. 2015 . Quatre troupeaux de bovins ont été sélectionnés dans la région sud de l’État du Mexique, un troupeau appartenant à la municipalité de Temascaltepec et trois troupeaux appartenant à la municipalité de Zacazonapan. Un total de 103 échantillons, 35 échantillons de lait et 68 échantillons d’exsudat nasal, ont été collectés. La répartition du nombre et du type d’échantillons collectés dans chaque troupeau est présentée dans le tableau 1.

2.2. Obtention d’échantillons de lait et d’exsudat nasal

La mamelle et les mamelons ont été nettoyés avec de l’eau purifiée et du savon, puis séchés avec des serviettes en papier, et l’asepsie des mamelons a ensuite été réalisée à l’aide de tampons imbibés d’alcool à 70 %. Cinq millilitres de lait ont été recueillis directement sur la tétine dans des récipients stériles de 20 ml, en jetant le flux initial. L’exsudat nasal a été recueilli directement à l’intérieur de l’orifice nasal à l’aide d’un écouvillon stérile de 10 cm de long, qui a ensuite été immergé dans une solution saline isotonique (0,85 %). Les échantillons de lait et d’exsudat nasal ont été conservés à 4°C jusqu’au traitement.

2.3. Traitement des échantillons

2.3.1. Isolement des mycobactéries

Les échantillons de lait ont été centrifugés à 2500 tours par minute (rpm) pendant 10 minutes. Les culots des échantillons de lait et d’exsudat nasal ont été inoculés dans le milieu de culture suivant, sélectif pour les mycobactéries : Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521), et Middlebrook (BD BBL 254521) complété par 6 g de pyruvate de sodium par litre (Middlebrook-P). Les milieux inoculés ont été incubés à 37°C pendant 8 semaines et ont été évalués tous les 3 jours.

2.3.2. Classification des souches isolées

Les souches isolées ont été réparties en groupes en fonction des caractéristiques suivantes : pigmentation des colonies, temps de croissance et caractéristiques des colonies (forme, consistance, texture et production de pigments). Les souches isolées ont été colorées avec Ziehl-Neelsen pour confirmer la présence de bacilles acido-fast (AFB) .

2.4. Extraction de l’ADN

Les souches présentant des caractéristiques microscopiques similaires à celles des mycobactéries (positivité des bacilles acido-alcooliques) et deux souches représentatives de chaque groupe ont été sélectionnées pour être identifiées. Pour obtenir la biomasse, les souches ont été inoculées dans 30 ml de milieu de culture liquide Middlebrook (BD BBL 254521) dans des flacons de 125 ml et incubées à 37°C pendant 7 jours. Le milieu liquide a été transféré dans des tubes Falcon stériles de 15 mL et centrifugé pendant 15 minutes à 14 000 rpm. Ensuite, le surnageant a été retiré et le culot a été transféré dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL ; les tubes ont ensuite été centrifugés à 14 000 rpm × 5 minutes, et le surnageant a été jeté. L’extraction de l’ADN a été effectuée sur le culot résultant à l’aide du kit de purification d’ADN génomique Wizard (Promega A1120).

2.5. Détection du marqueur moléculaire dans le gène de l’ARNr 23S

Le marqueur moléculaire de 100 pb situé sur le gène de l’ARNr 23S a été amplifié selon la méthodologie décrite par Roller et al. (1992) en utilisant les amorces suivantes : 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, et 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

La réaction a été réalisée à l’aide d’une ADN polymérase Taq commerciale (Promega M1661). Les conditions de cycle thermique suivantes ont été utilisées : une étape de prédénaturation pendant 5 minutes (94°C) ; 29 cycles de dénaturation pendant 30 secondes (94°C), d’hybridation pendant 45 secondes (46°C) et d’élongation pendant 50 secondes (72°C) ; et, enfin, un cycle de postélongation de 5 minutes (72°C). Les fragments amplifiés ont été confirmés sur un gel d’agarose à 2% coloré au bromure d’éthidium (SIGMA 46065).

2.6. Amplification du gène de l’ARNr 16S

Les souches qui ont amplifié le marqueur phylogénétique de 100 pb ont été sélectionnées pour l’analyse de séquençage de l’ARNr 16S. Les amorces suivantes ont été utilisées pour l’amplification : 8f : AGAGTTTGATCMTGGCTCAG et 1492r : TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

La réaction a été réalisée à l’aide d’une ADN polymérase Taq commerciale (Promega M1661). Les conditions de cycle thermique suivantes ont été utilisées : une étape de prédénaturation pendant 5 minutes (94°C) ; 34 cycles de dénaturation pendant 30 secondes (94°C), d’hybridation pendant 20 secondes (52°C) et d’élongation pendant 1 minute 30 secondes (72°C) ; et, enfin, un cycle de postélongation de 7 minutes (72°C).

Les fragments amplifiés ont été confirmés sur un gel d’agarose à 1% coloré au bromure d’éthidium (SIGMA 46065). Les produits de cette amplification ont été purifiés à l’aide du kit Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) et confirmés sur un gel d’agarose à 1% pour vérifier leur présence et leur qualité.

2.7. Identification des espèces de Mycobacterium

Les produits amplifiés du gène de l’ARNr 16S ont été envoyés au service de séquençage Macrogen, Maryland, USA. Les séquences obtenues ont été analysées et corrigées à l’aide du programme BioEdit . Des séquences de consensus ont été construites à partir des fragments avant et arrière, qui ont été comparées aux séquences déposées précédemment dans la GenBank du National Center for Biotechnology Information (NCBI) en utilisant le programme BLAST et EzTaxon 2.1 .

2.8. Analyse phylogénétique

Des séquences du gène de l’ARNr 16S ont été obtenues pour les espèces mycobactériennes suivantes à partir de l’American Type Culture Collection (ATCC) et de la German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM) : M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , et M. confluentis . Les séquences des souches de la collection et celles des souches isolées dans la présente étude ont été alignées avec le programme BioEdit . L’analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant la méthode de parcimonie maximale dans le logiciel MEGA version 4 . Pour former la racine du cladogramme, la séquence de Pantoea agglomerans DSM 3493 a été utilisée.

3. Résultats

Les 108 souches isolées des 103 échantillons collectés ont été réparties en 13 groupes selon leurs caractéristiques morphologiques macroscopiques et microscopiques (tableau 2). Les groupes 11 et 12, en particulier, étaient composés de souches acidophiles.

Pour l’identification au niveau de l’espèce, 39 souches ont été choisies : 10 d’entre elles appartiennent au groupe 11 et 7 au groupe 12. Deux souches de chacun des 11 groupes restants ont été sélectionnées pour compléter les 39 souches. Le marqueur moléculaire de 100 pb a été trouvé dans 33% (13/39) des souches sélectionnées. Pour elles, le gène de l’ARNr 16S a été amplifié pour le séquençage et l’identification au niveau de l’espèce.

La prévalence globale des MNT sur les échantillons collectés était de 12,6% (13/103) en considérant les échantillons de lait et d’exsudat nasal. Cependant, la prévalence spécifique des échantillons d’exsudat nasal était de 19,1 % (13/68).

Selon la comparaison des séquences, quatre espèces de MNT du genre Mycobacterium ont été identifiées ; 64 % (6/13) des souches présentaient 98 % et 99 % de similitudes avec M. neoaurum, tandis que 31% (4/13) avaient 99% de similitudes avec M. parafortuitum, 15% (2/13) avaient des similitudes de 98% et 99% avec M. moriokaense, et, enfin, 8% (1/13) avaient 99% de similitudes avec M. confluentis (tableau 3).

L’arbre phylogénétique a été formé avec le genre Mycobacterium et quatre de ses espèces par lequel les relations phylogénétiques entre les souches de la collection et les souches isolées dans la présente enquête ont été observées (Figure 1).

Figure 1

Arbre phylogénétique construit en comparant les séquences du gène ARNr 16S des souches isolées et de référence.

4. Discussion

Les espèces de MNT ont été isolées à partir d’échantillons d’exsudat nasal uniquement, ce qui a éliminé les échantillons provenant d’une des fermes locales de cette étude (tableau 1). Nous avons constaté que la prévalence spécifique était de 19,1 % dans les troupeaux de la région sud de l’État du Mexique. Des études similaires menées aux États-Unis, en Afrique du Sud, en Tanzanie et au Brésil ont rapporté des valeurs de prévalence de MNT de 3,4 %, 24,5 %, 7 % et 7,8 %, respectivement ; par conséquent, la valeur de prévalence trouvée dans cette étude se situe dans la fourchette rapportée précédemment. Dans cette étude, 13 des 39 souches analysées ont été identifiées comme les espèces de MNT M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis et M. parafortuitum.

M. neoaurum, un membre du complexe Mycobacterium parafortuitum, est responsable d’un large spectre de maladies, la plupart d’entre elles étant des infections liées à des dispositifs tels que les cathéters Hickman, les cathéters BROVIAC, les lignes PICC , la fistule artério-veineuse qui comprenait une greffe de polytétrafluoroéthylène , les pace makers , et l’endocardite de la valve prothétique . Les patients immunodéprimés porteurs de ces dispositifs sont les principaux hôtes, par exemple les patients atteints de cancer et les diabétiques souffrant d’insuffisance rénale et de problèmes cardiaques. M. neoaurum a également été isolé chez des patients présentant des infections urinaires, des méningo-encéphalites et des altérations du système nerveux central, des bactériémies et des endocardites, ainsi que des infections pulmonaires. Bien qu’il ait été principalement isolé à partir de cas cliniques, il existe également des rapports sur son isolement dans le lait et le bétail .

M. moriokaense a été isolé à partir d’un échantillon de crachats . Bien qu’il soit considéré comme non pathogène pour l’homme, il a été associé à des maladies pulmonaires . M. confluentis a été isolé à partir d’échantillons d’expectoration également , et, avec M. parafortuitum, les deux sont considérés comme des espèces non pathogènes. M. confluentis, M. moriokaense et M. neoaurum ont été isolés de différents tissus de bovins et d’animaux sauvages présentant des lésions tuberculeuses, tandis que M. parafortuitum n’a été isolé que du lait de bovins. Cependant, dans notre travail, M. parafortuitum n’a été isolé qu’à partir d’échantillons d’exsudat nasal.

Les besoins nutritionnels des mycobactéries diffèrent selon les espèces, ce qui a motivé l’utilisation de différents milieux de culture. Notamment, sept des 13 souches identifiées dans cette étude ont été isolées dans le milieu Stonebrink, y compris M. neoaurum, M. parafortuitum, et M. moriokaense. Ce résultat est conforme à celui décrit par Sepúlveda et al. qui ont indiqué que le milieu Stonebrink est approprié pour la récupération de différentes espèces du genre Mycobacterium. García-Martos et García-Agudo ont rapporté que le milieu Middlebrook est optimal pour l’isolement des actinomycètes, ce qui est en accord avec la présente investigation considérant que deux espèces, M. neoaurum et M. parafortuitum, ont été isolées dans ce milieu. Notamment, M. confluentis n’a été isolé que dans le milieu Middlebrook complété par du pyruvate de sodium ; ainsi, la stratégie d’utilisation de différents milieux de culture était appropriée car elle a permis l’isolement de différentes espèces du genre Mycobacterium.

La détection du marqueur moléculaire présent dans le gène de l’ARNr 23S des bactéries Gram-positives à teneur en HGC a permis de discriminer les souches d’eubactéries et de mycobactéries. L’analyse du séquençage du gène de l’ARNr 16S a rendu possible l’identification au niveau de l’espèce ; par conséquent, la combinaison de ces méthodologies est appropriée pour l’identification des espèces de MNT.

5. Conclusions

En utilisant la méthodologie décrite dans cette étude, quatre espèces de MNT ont été isolées et identifiées : M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum, et M. parafortuitum. Ces espèces ont été isolées pour la première fois à partir d’exsudats nasaux de bovins de la région sud de l’État de Mexico. Trois des espèces identifiées (M. neoaurum, M. moriokaense et M. confluentis) ont une importance en matière de santé publique et de médecine vétérinaire.

Divulgation

Ce travail est issu de la thèse pour le grade de docteur en sciences de la santé (Universidad Autónoma del Estado de México), enregistrée dans le PNPC-CONACYT.

Conflits d’intérêts

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflits d’intérêts.

Reconnaissance

Les auteurs tiennent à remercier l’aide financière du Secrétaire de la recherche et des études supérieures de l’Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) à travers les subventions de recherche suivantes : (i)  » Mise en œuvre des systèmes d’information géographique et des techniques de biologie moléculaire, comme outils de détection et d’identification de Mycobacterium spp. « , SIEA-UAEM 3486/2013CHT, et (ii) le réseau  » Microbiología y química en las Ciencias de la Salud « , 039/2014RIF.