Matériaux

La duloxétine (DLX) de qualité pure a été gracieusement fournie en échantillons cadeaux par Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, Inde. Les grades 100 M, 4CM et 15 M CR d’hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC) ont été généreusement fournis par Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Inde. Tous les autres produits chimiques et réactifs de laboratoire utilisés dans l’étude étaient de qualité réactif analytique. De l’eau doublement distillée a été utilisée tout au long de l’étude. Le polyéthylène glycol 400 a été acheté chez S.D. Fine Chem Ltd, Boisar, Inde. L’hydrogénophosphate disodique, le dihydrogénophosphate de potassium et l’hydroxyde de sodium ont été achetés chez CDH Ltd, New Delhi, Inde. L’éthanol absolu a été obtenu auprès de Changshu Yangyuan Chemical, Chine. Le n-octanol a été acheté auprès de E-Merck (India) Ltd. à Mumbai, Inde. La membrane de dialyse 150 a été achetée auprès de Hi Media Laboratories Ltd. à Mumbai. Tous les matériaux et poudres ont été stockés sous vide à température ambiante.

Equipements

Les spectres UV ont été enregistrés sur le spectrophotomètre Perkin Elmer lambda 15 UV/visible dans la gamme UV/visible de 190 à 600 nm. L’assemblage de la cellule de diffusion Franz a été obtenu auprès de Permegear, Inc, USA. Le spectrophotomètre infrarouge FT-IR-8300 a été obtenu auprès du spectrophotomètre FTIR PE RX 1 de Perkin Elmer. Les spectres de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) ont été obtenus en utilisant le modèle DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). La centrifugeuse de recherche provenait de REMI Equipments, Mumbai, Inde. Le pH-mètre CyberScan pH 510 a été fourni par Eutech Instruments, Inde.

Etudes de préformulation

Préparation de la solution saline tamponnée au phosphate pH 7.4

0,19 g de dihydrogénophosphate de potassium, 2,38 g d’hydrogéno-orthophosphate disodique et 8,0 g de NaCl ont été dissous dans de l’eau distillée, et le volume a été complété à 1000 ml avec de l’eau distillée. Le pH du tampon a été ajusté à 7,4.

Quantification du chlorhydrate de duloxétine

La teneur en duloxétine a été analysée par spectrophotométrie UV dans une solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4. Le balayage de la solution mère a été effectué dans la gamme UV de 190 à 400 nm. Le λ max a été obtenu à la longueur d’onde de 289 nm. La solution mère A (250 μ/ml) de chlorhydrate de duloxétine a été préparée en dissolvant 0,0250 g du médicament dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4) à 100 ml. En outre, des dilutions en série allant de 1 μg/ml à 100 μg/ml de duloxétine ont été préparées par dilution des solutions mères A et B avec un tampon phosphate (pH 7,4). Les valeurs d’absorbance des dilutions ont été notées à λ max de DLX, c’est-à-dire, 289 nm contre une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4) prise comme blanc, et une courbe d’étalonnage a été tracée.

Caractérisation physico-chimique du chlorhydrate de duloxétine

Détermination du point de fusion

Une petite quantité de chlorhydrate de duloxétine a été prise dans un tube capillaire (fusionné à une extrémité) et placée dans un appareil de point de fusion, et la température de fusion a été enregistrée. Trois mesures distinctes ont été prises à cet effet, et leur valeur moyenne a été obtenue.

Détermination du coefficient de partage

Le coefficient de partage du chlorhydrate de duloxétine a été déterminé dans un système octanol-eau (Wells 2002). Les deux phases ont été prises dans un rapport 1:1 v/v et mutuellement saturées dans un agitateur à bain-marie à 37 °C, puis les deux phases ont été séparées. Dix milligrammes du médicament ont été ajoutés à un mélange de 20 ml de phase organique pré-saturée et de 20 ml d’eau pré-saturée et agités pendant 10 min. Les flacons ont ensuite été maintenus à 37 °C pendant 24 heures avec une agitation intermittente. Le mélange a ensuite été centrifugé pour séparer les phases aqueuse et non aqueuse. Les deux phases ont été analysées séparément pour la duloxétine par spectrophotométrie. Le coefficient de partage du médicament « K o/w » a ensuite été calculé à partir du rapport de la concentration du médicament dans l’octanol et la phase aqueuse.

Etudes d’interaction médicament-polymère

Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) a été employée pour analyser le médicament pur DLX, le mélange physique de DLX et de HPMC (15 CR, 100 M et 4 M), ainsi que les patchs transdermiques chargés en médicament en employant la méthode des pastilles de KBr. Tous les échantillons ont été scannés de 400 à 4000 cm-1.

Calorimétrie différentielle à balayage

Les interactions possibles entre le médicament et le polymère utilisé ont été analysées à partir des thermogrammes DSC du médicament pur chlorhydrate de duloxétine et de la formulation (HPMC + médicament) obtenus en utilisant le modèle DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Tous les échantillons ont été scellés dans des casseroles en aluminium à fond plat et chauffés sur une plage de température de 25 à 300 °C à un taux d’augmentation de 5 °C/min.

Fabrication de patchs transdermiques

Des films transdermiques contenant du chlorhydrate de duloxétine ont été coulés sur une lame de verre par la méthode d’évaporation du solvant en utilisant différents grades (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) de HPMC en présence et en l’absence d’un plastifiant. Le PEG 400 (5%) a été utilisé comme plastifiant dans tous les cas. Le tableau 1 présente les formules et la composition des différents types de patchs formulés. Le chlorhydrate de duloxétine (60 mg) a été dissous dans un mélange de solvants eau-méthanol (7:3). La matrice du médicament a été préparée en dissolvant des concentrations variables (1% et 1,5% p/v) de HPMC dans le même système de solvant. La solution a été maintenue non perturbée pendant 24 h. Puis, à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, la solution a été versée dans un anneau de verre de 5,0 cm de diamètre placé sur la surface du verre. On a laissé le solvant s’évaporer pendant 6 heures dans un four à régulation thermostatique à 60°C. Les patchs ont été stockés dans un récipient hermétique dans des conditions ambiantes pendant 7 jours avant utilisation.

Tableau 1 Formules et composition des systèmes transdermiques formulés de duloxétine HCl

Evaluation des patchs transdermiques

Aspect physique

Tous les patchs préparés ont été inspectés visuellement pour la couleur, la clarté, la flexibilité et la douceur.

Epaisseur du patch

L’épaisseur des patchs chargés en médicament a été mesurée en utilisant un micromètre à vis en trois points différents sur les patchs. Les valeurs moyennes et les valeurs d’écart type des trois lectures ont été calculées pour chaque patch chargé de médicament.

Uniformité du poids

Les patchs ont été soumis à un test de variation de poids en pesant tous les patchs sur une machine de pesage numérique. Les déterminations ont été effectuées en triplicata pour chaque formulation. Le poids moyen et les valeurs de déviation standard ont ensuite été calculés.

Etude de planéité

L’étude de planéité a été menée pour évaluer que les timbres transdermiques préparés possèdent une surface lisse et ne se rétrécissent pas avec le temps. Trois bandes longitudinales ont été découpées dans le film à trois endroits différents. La longueur de chaque bande a été mesurée et la variation de longueur due à la non-uniformité de la planéité a été déterminée en pourcentage de constriction, une constriction de 0 % équivalant à une planéité de 100 %. Le pourcentage de constriction a été obtenu par (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Ici, l 1 est la longueur initiale de chaque bande, et l 2 est la longueur finale de chaque bande.

L’endurance au pliage

Ce test a été effectué pour vérifier l’efficacité du plastifiant et la résistance du patch préparé en utilisant différents polymères. L’endurance au pliage est définie comme le nombre de plis nécessaires pour briser un patch polymérique. La résistance au pliage a été mesurée manuellement en pliant plusieurs fois une petite bande du film (2 × 2 cm) au même endroit jusqu’à ce qu’elle se casse. Le nombre de fois où le patch a pu être plié au même endroit sans se casser ou se fissurer a donné la valeur de la résistance au pliage. Trois patchs de chaque type ont été pris pour le test.

Pourcentage d’absorption d’humidité/absorption de vapeur d’eau

Le test d’absorption d’humidité en pourcentage a été effectué pour vérifier la stabilité physique et l’intégrité des films dans des conditions de forte humidité. Les films préparés (3,14 cm2) ont été pesés individuellement avec précision et exposés à 85 ± 5% d’humidité relative dans un dessiccateur contenant 100 ml de solution saturée de chlorure de potassium à température ambiante. Pendant cette période, les films ont été pesés à intervalles réguliers de 24, 48 et 72 h. Le pourcentage d’absorption d’humidité a été déterminé à partir de la formule suivante :

Pourcentage d’humidité

Ce test a également été effectué pour vérifier l’intégrité des films dans des conditions sèches. Les films transdermiques individuels (de surface spécifiée) ont été maintenus dans un dessiccateur contenant du chlorure de calcium anhydre fondu à température ambiante. Pendant cette période, les films ont été pesés à intervalles réguliers de 24, 48 et 72 h. Le pourcentage d’humidité a été déterminé à l’aide de la formule suivante :

Transmission de vapeur d’eau

Le taux de transmission de vapeur d’eau (WVTR) est défini comme la quantité d’humidité transmise par unité de surface du film en une unité de temps. Des fioles en verre de volume et de diamètre égaux ont été utilisées comme cellules de transmission. Les cellules ont été lavées correctement et séchées à l’étuve. Ensuite, environ 1 g de chlorure de calcium fondu anhydre a été placé dans chaque fiole, et le patch a été fixé sur le bord de la fiole à l’aide d’un ruban adhésif. Ces flacons ont ensuite été pesés et placés dans des dessiccateurs contenant une solution saturée de chlorure de potassium pour maintenir une humidité relative de 84%. Ces cellules ont été retirées des dessiccateurs et pesées après le 1er, le 2e, le 3e, le 4e, le 5e, le 6e et le 7e jour. Le taux de transmission de la vapeur d’eau a été déterminé comme suit :

$$ W.\V.\T. = WL/S $$

Où W est le poids des vapeurs d’eau transmises, L est l’épaisseur du patch et S est la surface exposée en centimètre carré.

Phosphore de surface

Les patchs ont été maintenus en contact avec 0,5 ml d’eau doublement distillée pendant 1 h dans des tubes en verre et on les a laissés gonfler. Une électrode de verre combinée a été amenée près de la surface du patch et des lectures de pH ont été effectuées après avoir laissé une période d’équilibrage de 1 min.

Détermination de la teneur en médicament

Des morceaux de taille 2 × 2 ont été coupés de chaque type de formulation et mis dans 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4. Le contenu a été agité magnétiquement pendant 2 h. La solution a ensuite été filtrée à travers un papier filtre Whatman (0,45 μ) et diluée de manière appropriée avec une solution saline tampon phosphate pH 7,4. La solution a ensuite été analysée pour son absorbance à 289 nm en utilisant le patch placebo comme blanc. A partir des valeurs d’absorbance, la teneur en médicament a été déterminée.

La libération du médicament in vitro

La cellule de diffusion de Franz a été employée pour la caractérisation in vitro des formulations transdermiques. Il s’agit d’une méthode fiable pour la prédiction du transport de médicaments à travers la peau à partir de formulations topiques. Le compartiment récepteur de la cellule de diffusion a été rempli de 30,0 ml de solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4), et des études de libération de médicament in vitro ont été réalisées en utilisant une membrane de cellophane synthétique. Les formulations préparées ont été appliquées sur la membrane dans le compartiment donneur et se sont étalées uniformément sur la membrane de cellophane. L’ensemble a été maintenu en permanence à 37,0 ± 2,0 °C à 50 rpm. Des échantillons (aliquotes de 1,0 ml) ont ensuite été prélevés à des intervalles de temps appropriés (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 et 24 h) et remplis d’une quantité de milieu permettant de maintenir le volume de la phase réceptrice à 30 ml. Les échantillons ont été analysés par spectrophotométrie à 289 nm.

Etudes de perméation des médicaments/ex vivo

Les études de perméation des médicaments ont été réalisées en utilisant la peau de rats Wistar mâles. Les rats ont été sacrifiés par dislocation vertébrale. Les échantillons de peau ont été coupés, retirés et lavés avec du sérum physiologique. La graisse et le tissu conjonctif adhérant ont été retirés à l’aide de pinces à bouts arrondis. La peau a été conservée dans une solution saline normale pendant 6 h. Les poils de la peau du rat ont été soigneusement rasés pour éviter toute lésion périphérique. Le compartiment récepteur de la cellule de diffusion de Franz a été rempli de 30 ml de solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Les formulations préparées ont été appliquées sur la peau du rat dans le compartiment donneur. La température du montage a été constamment maintenue à 37 ± 2 °C et la vitesse d’agitation contrôlée à 50 rpm. Des échantillons (aliquotes de 5 ml) ont été prélevés à des intervalles de temps appropriés (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 et 24 h) et remplacés par la même quantité de milieu pour maintenir le volume de la phase réceptrice à 30 ml. Les échantillons ont été analysés par spectrophotométrie à λ max de 289 nm.

Etudes d’irritation cutanée

L’autorisation éthique pour la manipulation des animaux expérimentaux a été obtenue auprès du comité institutionnel d’éthique animale (IAEC), Université Panjab, Chandigarh, et les études ont été menées conformément au protocole approuvé.

Les rats albinos Wistar ont été logés dans des cages, avec un libre excès de régime alimentaire standard de laboratoire et d’eau. La peau abdominale dorsale des rats a été rasée soigneusement en évitant les lésions périphériques, avant 24 heures de réalisation de l’étude. Le patch transdermique a été appliqué sur la peau nue et recouvert d’un ruban microporeux non sensibilisant. Une solution aqueuse de formaline à 0,8 % v/v a été appliquée comme irritant cutané standard. Les animaux ont reçu un nouveau patch chaque jour jusqu’à 7 jours. La formulation a été retirée après 7 jours ; le score d’érythème a été enregistré et comparé à la norme. Le score d’érythème a été lu et enregistré par la méthode de notation de Draize (Draize et al. 1944) comme suit : score 0 pour l’absence d’érythème, score 1 pour un très léger érythème (rose clair), score 2 pour un érythème bien défini (rose foncé), score 3 pour un érythème modéré à sévère (rouge clair) et score 4 pour un érythème sévère (rouge foncé).

Analyse des données

Pour le nième échantillon, V s est le volume d’échantillon prélevé, V t est le volume total de milieu récepteur, C c est la concentration corrigée, C u est la concentration non corrigée du nième échantillon, et C i est la concentration non corrigée. En outre, la concentration corrigée a été utilisée pour calculer les valeurs de la quantité de médicament libéré et du pourcentage de médicament libéré à chaque temps d’échantillonnage ainsi que la vitesse de libération du médicament.

Le coefficient de perméabilité est la vitesse de passage du médicament à travers la membrane/peau en μg/cm2/h. Le coefficient de perméabilité a été calculé à partir de la pente du graphique du pourcentage de médicament transporté en fonction du temps, comme suit : P = pente × V d/S

Ici, V d est le volume de la solution donneuse en millilitre, et S est la surface du tissu en centimètre carré.

Le flux (valeur J) est défini comme la quantité de matériau s’écoulant à travers une barrière à section transversale unitaire en un temps unitaire. Il est calculé par: