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Overview

Les ligands radioactifs sont couramment utilisés pour mesurer la liaison des ligands aux récepteurs. Dans ce test, vous mesurerez la liaison d’un ligand radiomarqué aux cellules ou aux membranes cellulaires contenant un récepteur d’intérêt. Les cellules entières et les membranes cellulaires peuvent être utilisées pour cet essai. Les radioligands peuvent être utilisés pour réaliser des courbes de saturation, des expériences de compétition et de cinétique.

La liaison ligand-récepteur

Lorsque vous choisissez un radioligand, il y a quelques facteurs à garder à l’esprit :

• Activité spécifique élevée : Les radioligands ayant une activité spécifique élevée sont bien adaptés aux essais de liaison de ligands. L’activité spécifique indique la quantité de radioactivité par molécule de ligand, et est généralement donnée en unités de Curies par millimole de ligand. Plusieurs de nos ligands marqués au 125I sont proposés à une activité spécifique maximale (2200 Ci/mmol si un site de marquage 125I est disponible, 4400 Ci/mmol si deux sites de marquage 125I sont disponibles, etc.) Cela indique que pratiquement chaque molécule de ligand fournie dans le flacon de réserve est radiomarquée. Pour les ligands tritiés (ligands 3H), vous devriez idéalement choisir un ligand qui a une activité spécifique supérieure à 20 Ci/mmol. L’activité spécifique théorique maximale par tritium est de 29 Ci/mmol (Curies par millimole de tritium). Les activités spécifiques supérieures à cette valeur indiquent qu’en moyenne, chaque molécule de ligand possède au moins un tritium.
• Faible liaison non spécifique : Les ligands hydrophobes présentent généralement une liaison non spécifique plus élevée. Cela peut parfois être compensé en enduisant les filtres de BSA pour réduire la liaison non spécifique. L’inclusion de BSA, de sels ou de détergents dans le tampon de lavage ou de liaison peut également contribuer à réduire la liaison non spécifique. Si le produit radiochimique de base est conditionné dans un flacon silanisé (se référer à la fiche technique), cela peut indiquer que le ligand est quelque peu hydrophobe
• Haute pureté : Idéalement, le ligand devrait avoir une pureté radiochimique supérieure à 90%. La pureté radiochimique diminue avec le temps, et le taux réel de cette dégradation s’accélère avec le temps. La pureté radiochimique et les taux de dégradation de nos différents produits radiochimiques peuvent être trouvés sur les fiches techniques spécifiques aux lots.
• Haute sélectivité : Plus le ligand est sélectif pour votre récepteur, meilleures seront vos données. Une sélectivité élevée indique que le ligand sera principalement reconnu par un seul récepteur d’intérêt, par rapport aux autres récepteurs qui peuvent être présents dans une membrane cellulaire. De plus, l’utilisation de membranes qui surexpriment le récepteur d’intérêt peut aider à réduire toute contribution potentielle des récepteurs exprimés de manière endogène dans la membrane.
• Stabilité : Si vous devez utiliser votre radioligand sur une période de temps prolongée, la stabilité peut être un facteur pour vous. Les ligands marqués au 125I doivent généralement être utilisés dans un délai d’un à deux mois après la date de fabrication. Les ligands tritiés doivent généralement être utilisés dans les 3 à 6 mois suivant la date de fabrication ; il existe toutefois des exceptions à cette règle. Les taux de dégradation et les dates de fabrication sont indiqués sur nos fiches techniques spécifiques aux lots. Vous pouvez également contacter le support technique pour discuter de la durée d’utilisation recommandée pour chaque produit radiochimique PerkinElmer – nos coordonnées se trouvent dans le coin supérieur droit de cette page.
• Énergie : le 3H libère de l’énergie bêta, qui peut être mesurée sur un compteur à scintillation après l’ajout de scintillant (sous la forme d’un cocktail de scintillation, de scintillant solide Meltilex®, d’une bille SPA, etc.) L’énergie bêta interagit avec le scintillant pour produire des photons, qui sont mesurés par le détecteur. Le 125I libère à la fois de l’énergie bêta et de l’énergie gamma. Si vous n’avez accès qu’à un compteur gamma, vous devez utiliser un radioligand marqué à l’125I. Un autre facteur est le format du test. Le 125I dégage plus d’énergie de type bêta que le 3H. Pour les dosages SPA, les ligands marqués au 3H ou au 125I peuvent être utilisés efficacement.

Les dosages de liaison de ligands radioactifs peuvent être réalisés est plusieurs formats différents. Typiquement, nous effectuons ce test dans le format de filtration, mais le test peut également être effectué dans le format SPA. Le format SPA est un format homogène, ce qui signifie qu’aucune étape de lavage n’est nécessaire. Dans le test de filtration, vous allez laver le ligand non lié en utilisant un collecteur à vide ou une récolteuse de cellules.

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Formats d’essai

Essais de liaison de ligand par filtration

Voir plus d’informations sur les matériaux dont vous avez besoin, les optimisations que vous pouvez avoir à effectuer et les références pour les essais de liaison de ligand radioactif sur plaque de filtration. Dans le format de filtration, l’essai de liaison est d’abord réalisé dans une plaque d’essai, puis filtré à travers une plaque filtermat ou UniFilter® à l’aide d’un collecteur de cellules (collecteur à vide). Les filtres sont lavés pour éliminer tout radioligand non lié. La plaque filtermat ou UniFilter est ensuite séchée et un cocktail de scintillation (ou Meltilex®) est ajouté avant la lecture dans un détecteur approprié.

Tests de liaison de ligands SPA

Voir plus d’informations sur le matériel dont vous avez besoin, les optimisations que vous pouvez avoir à effectuer et les références pour les tests de liaison de radioligands SPA. Dans le format SPA, les membranes cellulaires sont capturées sur des billes SPA. Lorsque le radioligand se lie au récepteur/membrane, le produit radiochimique se trouve à proximité de la bille SPA. L’énergie bêta du radioligand peut interagir avec le scintillant de la bille, produisant un signal qui peut être mesuré. Le radioligand qui n’est pas lié à la membrane cellulaire ne sera pas assez proche de la bille SPA pour interagir fortement avec le scintillant.

Vue d’ensemble de la liaison du ligand

Définitions

• Affinité (puissance) : l’étanchéité avec laquelle le ligand se lie au récepteur. Elle est généralement exprimée par une constante d’équilibre, Kd. Plus la valeur Kd est faible, plus l’affinité est élevée.
• Spécificité : décrit la sélectivité d’un ligand pour un récepteur par rapport à d’autres récepteurs similaires
• Kd : La concentration à laquelle 50% des récepteurs sont occupés par le radioligand

Classification pharmacologique des ligands

Ligands

• Agoniste complet : un ligand qui se lie à un récepteur et l’active et déclenche une réponse maximale
• Agoniste partiel : un ligand qui se lie à un récepteur et produit une réponse sous-maximale
• Antagoniste : un ligand qui se lie à un récepteur qui n’active pas le récepteur. Les antagonistes ne déclenchent aucune réponse lorsqu’ils sont appliqués seuls. Ils bloqueront les effets d’un ligand agoniste concurrent.
• Agoniste inverse : un ligand qui se lie à un récepteur et diminue la réponse en dessous du niveau basal

Essais

I. Expérience de saturation : Mesure l’équilibre de liaison en effectuant un titrage de radioligand, en maintenant constante la quantité de récepteur.

Vous pouvez utiliser les courbes de saturation pour déterminer Bmax (niveau d’expression du récepteur) et Kd (affinité de liaison du ligand).

Saturation experiment

• Liaison totale : Augmentation de la concentration de radioligand en l’absence de ligand froid. Mesure à la fois la liaison spécifique au récepteur, ainsi que la liaison non spécifique.
• Liaison non spécifique : Augmentation de la concentration du radioligand en présence d’un ligand froid. Mesure la liaison du radioligand aux composants non récepteurs.
• Liaison spécifique : Liaison totale moins liaison non spécifique. Mesure la liaison au récepteur, spécifiquement.

II. Expérience de compétition : Mesure la liaison à l’équilibre d’une seule concentration de radioligand en présence de diverses concentrations de concurrent non marqué.

Vous pouvez utiliser les courbes de compétition pour déterminer l’affinité d’un grand nombre de composés non marqués pour un récepteur en cours de criblage. La CI50 et le Ki peuvent être dérivés des données de compétition.

Courbe de compétition

• CI50 : Concentration d’un ligand concurrent qui déplace la moitié du ligand radioactif
• Ki : affinité d’un ligand froid pour le récepteur

Note : En changeant la concentration du radioligand, on peut observer un déplacement de la CI50 d’un composé de référence ; cependant, le Ki reste le même.

III. Expériences cinétiques : Mesurer le niveau de liaison à différents moments pour déterminer les constantes de vitesse d’association et de dissociation du radioligand.

Cinétique

• Concentration saturante de ligand ajouté une quantité liée au fil du temps pour déterminer le Kon
• Haute concentration de concurrent non marqué ajouté. et diminution de la liaison au cours du temps mesurée pour déterminer le Koff

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Tips et FAQ

Enfin, vous voudrez sélectionner un radioligand qui présente les propriétés suivantes :

• Haute activité spécifique (> 20 Ci/mmol pour un ligand tritié)
• Faible liaison non spécifique (les ligands hydrophobes présenteront généralement une liaison non spécifique plus élevée)
• Haute pureté (généralement > 90% de pureté)
• Haute sélectivité
• Stabilité (si vous devez utiliser votre radioligand pendant une période prolongée, la stabilité peut être un facteur. Les ligands marqués au 125I doivent généralement être utilisés dans un délai d’un à deux mois après la date de fabrication. Les ligands tritiés doivent généralement être utilisés dans les 3 à 6 mois suivant la date de fabrication (il existe toutefois des exceptions à cette règle).

Lorsque vous tracez vos données, nous vous recommandons d’utiliser la concentration déterminée expérimentalement de vos solutions de travail de radioligand, plutôt qu’une concentration calculée. Certains radioligands vont coller aux parois de vos tubes de dilution. Il est important de déterminer la concentration réelle de votre radioligand pipeté. Pour déterminer expérimentalement la concentration d’une dilution de radioligand, pipettez quelques microlitres de votre tube de dilution et déposez-les sur un filtre. Il est possible que vous souhaitiez également déposer une dilution 1/10 de cet échantillon, afin de pouvoir vérifier vos résultats par recoupement. Déterminez les dpms (désintégrations par minute). Convertissez les dpms en Curies en utilisant l’équation suivante :

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Puis utilisez l’activité spécifique de votre lot de radioligand pour convertir les Curies en moles. Pour déterminer la concentration radioactive à ce stade, divisez le nombre de moles par le volume que vous avez déposé sur le filtre.

FAQs

Q. Quelle concentration de radioligand dois-je utiliser pour ma courbe de saturation ?
A. Nous vous recommandons généralement de choisir 3 à 5 concentrations inférieures à la Kd, et 3 à 5 concentrations supérieures à la Kd. La concentration la plus élevée doit être dix fois supérieure au Kd.

Q.Quelle concentration de radioligand doit-on choisir pour la liaison compétitive ?
A. Le radioligand est utilisé à une faible concentration, généralement à une valeur égale ou inférieure à sa valeur Kd. Si l’activité spécifique est faible, une concentration supérieure à la valeur Kd peut être utilisée mais elle ne doit jamais être égale ou supérieure à la concentration saturante.

Q. Quel type de ligand dois-je utiliser pour déterminer la liaison non spécifique dans mes courbes de saturation ?
A. Vous voulez généralement choisir un ligand qui est différent de votre radioligand. Vous voulez déplacer uniquement la liaison spécifique du radioligand au récepteur. Vous devez choisir un ligand qui a une affinité élevée pour le site de liaison du récepteur et une faible affinité pour les sites de liaison non spécifiques.

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Autres technologies de liaison récepteur-ligand de PerkinElmer

• Tests de liaison récepteur-ligand par fluorescence DELFIA

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