Définition des unités
Une unité d’activité d’endonucléase de restriction est définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour produire une digestion complète de 1 µg d’ADN substrat (ou de fragments) dans un volume réactionnel total de 50 µl en 60 minutes dans des conditions de dosage optimales, comme indiqué pour chaque endonucléase de restriction.
Détermination de l’activité volumique des endonucléases de restriction
Les essais d’activité des endonucléases de restriction sont réalisés en ajoutant différentes dilutions d’enzymes au tampon d’essai approprié contenant 1 µg d’ADN substrat. Après une incubation de 60 minutes à la température appropriée, la digestion est arrêtée et les échantillons d’ADN sont visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose/bromure d’éthidium. La solution enzymatique la plus diluée donnant une digestion complète est utilisée pour calculer l’activité en unités/µl.
Veuillez noter que l’activité dépend du substrat et que lorsque vous travaillez avec un nouveau substrat, l’enzyme doit être titrée pour déterminer l’activité réelle ou attendue.
Contrôles de qualité
Les résultats de tous les essais de contrôle de qualité sont rapportés sur la fiche technique fournie avec chaque enzyme.
Essai de surdigestion
Un essai de surdigestion a été utilisé comme détermination qualitative de la pureté de l’enzyme et de l’absence de DNases non spécifiques. Dans le test de surdigestion, des quantités croissantes de chaque endonucléase de restriction (généralement 10, 20, 30, 40, 50 unités) sont ajoutées à une série de tubes contenant 1 µg d’ADN substrat. Après une incubation de 20 heures dans les conditions d’essai recommandées, le nombre maximum d’unités donnant un schéma de bandes clair, net et normal est déterminé par électrophorèse sur gel d’agarose/bromure d’éthidium.
Pour réussir l’essai, l’enzyme doit donner un schéma de bandes inchangé dans des conditions de surdigestion jusqu’à 600 fois (unités x heures) par rapport à une digestion 2 fois. Si l’enzyme présente une activité « en étoile » à un excès fonctionnel inférieur à 600 fois, la description du produit comprend des informations sur l’excès fonctionnel auquel l’activité « en étoile » ne se produit pas.
Dosage des endonucléases non spécifiques
Pour doser la contamination par les endonucléases non spécifiques, chaque endonucléase de restriction est incubée avec un substrat plasmidique super enroulé dépourvu de la séquence de reconnaissance de l’endonucléase de restriction. Une seule entaille non spécifique dans l’ADN RF I le convertit en forme RF II (cercle entaillé). Des quantités croissantes d’enzyme (généralement 10, 20, 30, 40, 50 unités) sont ajoutées à une série de tubes contenant 1 µg d’ADN RF I (forme super enroulée). Après une incubation de 20 heures dans les conditions de test recommandées, les deux formes sont distinguées sur des gels d’agarose et le pourcentage de conversion de RF I en RF II est déterminé.
Test de ligature et de recoupe
Un test de ligature a été utilisé pour déterminer la pureté fonctionnelle de l’ADN après la digestion par enzyme de restriction. L’ADN substrat est complètement digéré avec un excès de 10 et 50 fois de l’endonucléase de restriction dans le tampon de test approprié, ligaturé avec l’ADN Ligase T4 et recoupé avec la même enzyme de restriction. Les ADN coupés, ligaturés et recoupés sont analysés par électrophorèse sur gel d’agarose/bromure d’éthidium. Un schéma de bandes normal indique des terminaisons 5 et 3 intactes ainsi que l’absence de nucléases ou de phosphatases contaminantes.
Stabilité
Toutes les endonucléases de restriction de Jena Bioscience sont réévaluées tous les 4 à 6 mois. Ce processus nous permet de garantir une activité enzymatique complète et des performances optimales pour chaque enzyme que nous expédions. En raison des excellents résultats de ces tests, nous avons prolongé les dates d’expiration de la plupart de nos enzymes à 18 mois.