ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSTIC DU DÉFICIT EN ALPHA-1-ANTITRYPSINE PAR L’ANALYSE DE L’ADN D’ENFANTS AVEC UNE MALADIE DU FOIE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 et Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Contexte – Le déficit en alpha-1-antitrypsine est une maladie génétique qui se transmet sous une forme co-dominante, autosomique. Le déficit en alpha-1-antitrypsine touche principalement les poumons et le foie entraînant, dans ce dernier cas, une cholestase néonatale, une hépatite chronique ou une cirrhose. Un diagnostic précis du déficit en alpha-1-antitrypsine peut être obtenu par une analyse biochimique ou moléculaire. Objectif – Le but de cette étude était d’utiliser l’analyse de l’ADN pour examiner la présence d’un déficit en alpha-1-antitrypsine chez 12 enfants soupçonnés d’être atteints de ce déficit et qui présentaient des caractéristiques de laboratoire et cliniques de la maladie. Patients et méthodes – Douze patients, âgés de 3 mois à 19 ans, qui présentaient des taux sériques d’alpha-1-antitrypsine inférieurs à la normale et/ou une maladie hépatique d’étiologie non définie ont été étudiés. Les allèles mutants S et Z du gène de l’alpha-1-antitrypsine ont été étudiés chez les 12 enfants. L’organisation du gène de l’alpha-1-antitrypsine a été analysée par amplification du génome par la réaction en chaîne par polymérase et digestion avec les enzymes de restriction Xmnl (allèle S) et Taq 1 (allèle Z). Résultats – Sept des 12 patients présentaient une maladie hépatique chronique d’étiologie non définie et les cinq autres patients présentaient de faibles taux sériques d’alpha-1-antitrypsine ainsi qu’un diagnostic de cholestase néonatale et/ou de maladie hépatique chronique d’étiologie non définie. Cinq des 12 patients étaient homozygotes pour l’allèle Z (ZZ) et deux avaient l’allèle S avec un autre allèle (*S) différent de Z. Conclusion – Ces résultats montrent que le déficit en alpha-1-antitrypsine est relativement fréquent chez les enfants présentant une maladie hépatique chronique d’étiologie non définie et/ou de faibles taux d’alpha-1-antitrypsine (41,6 %). Un diagnostic correct est important pour un suivi clinique efficace et pour le conseil génétique.

HEADINGS ¾ Déficit en alpha-1-antitrypsine. Diagnostic moléculaire. Biopsie du foie.

INTRODUCTION

L’alpha-1-antitrypsine (A1AT) est une glycoprotéine de 52 kDa produite principalement par les hépatocytes qui libèrent 2 g de cette protéine, par jour, dans la circulation sanguine(36). La principale fonction de l’A1AT est d’inhiber l’action de l’élastase neutrophile, une sérine protéase qui hydrolyse les fibres d’élastine dans les poumons(38). Les mutations du gène codant pour l’A1AT produisent une protéine sans capacité d’inhibition et peuvent entraîner l’accumulation de l’A1AT dans les corpuscules d’inclusion des hépatocytes, réduisant ainsi les taux sériques normaux de cette protéine(4). Cette déficience se traduit par un emphysème pulmonaire, une bronchite chronique ou une bronchectasie(9). L’accumulation d’A1AT mutante dans les hépatocytes peut également entraîner une cholestase néonatale, une hépatopathie chronique ou une cirrhose(33, 34).

Le gène A1AT est hautement polymorphe, co-dominant et est situé sur le bras long du chromosome 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Soixante-quinze¾ des allèles (désignés de A à Z en fonction de leurs points isoélectriques) ont été décrits pour ce gène sur la base de la focalisation isoélectrique du sérum entre pH 4 (anode) et pH 5 (cathode) dans des gels de polyacrylamide. Les variants communs migrent vers le centre du gel et appartiennent donc à la famille M (« middle »). Un variant déficient, décrit à l’origine par LAURELL et ERIKSSON en 1963(21), migre vers la cathode et est dénommé Z. Un autre variant, qui se déplace lentement dans le gel, est dénommé S(5). Ce « locus » polymorphe est généralement connu comme le système Pi (inhibiteur de protéase). La plupart des variants produisent de l’A1AT de quantité et de qualité normales(7, 8, 25). Cependant, certains allèles tels que les variants S et Z sont associés à un état déficient qui atteint des fréquences polymorphes comme les populations caucasiennes et des cas d’un allèle nul dans lequel la production de protéines est totalement absente ont été rapportés(10).

L’allèle S résulte de la substitution de l’adénine par la thiamine dans l’exon III du gène, ce qui entraîne l’échange de l’acide glutamique en position 264 contre la valine et la formation consécutive d’une structure protéique instable(10, 11, 19). L’allèle Z résulte de la substitution de la guanine en position 342 par l’adénine dans l’exon V du gène et conduit à la formation d’une protéine qui s’accumule sur la surface rugueuse interne du réticulum endoplasmique de l’hépatocyte(6). Le diagnostic d’un état déficient est généralement posé après quantification des niveaux sériques de la protéine et profil électrophorétique après focalisation isoélectrique (23, 37). Un diagnostic plus précis nécessite une analyse des gènes par des techniques basées sur l’ADN(12, 14, 26).

L’objectif de cette étude était d’identifier les porteurs des allèles S et Z chez les patients suspectés d’avoir cette déficience et qui présentaient des caractéristiques de laboratoire et cliniques de cette maladie.

PATIENTS ET MÉTHODES

Patients

Durant la période allant de février 1988 à août 1997, un grand nombre de patients ont été adressés au service de gastroentérologie pédiatrique, Université d’État de Campinas, Campinas, SP, Brésil, afin de rechercher des maladies hépatiques. De ce nombre, seuls 12 patients n’ont pas présenté de diagnostic définitif (résultats négatifs pour l’hépatite virale, l’hépatite auto-immune et la maladie de Wilson). Ces patients ont été soumis à une analyse moléculaire de l’A1AT.

Méthodes

1 ¾ Protocole d’étude

2 – Biopsie hépatique

Des biopsies hépatiques percutanées ont été obtenues selon la description du MOWAT(24) sous anesthésie locale chez des patients à jeun depuis au moins 4 h, présentant une veinoclyse et une activité prothrombinique normale. Le fragment obtenu a été immédiatement placé dans du formol à 10%, puis traité et coloré à l’hématoxyline-éosine, au trichrome de Masson, au bleu de Prusse et à l’imprégnation argentique des fibres du réticulum. Une coloration spéciale a été obtenue en utilisant le PAS (periodic acid-Schiff) suivi d’un traitement à la diastase. La persistance de granules cytoplasmiques d’aspect éosinophile même après l’utilisation de la diastase a été considérée comme positive pour le déficit en A1AT.

3 – Analyse moléculaire

Afin de rechercher les allèles mutants S et Z de l’A1AT, il a été procédé à une extraction d’ADN des leucocytes du sang périphérique selon la méthode décrite par WOODHEAD et al.(39).

RESULTATS

Cinq des 12 enfants étudiés étaient homozygotes Z (ZZ) alors que deux des enfants avaient l’allèle S associé à un autre allèle qui n’était pas Z (*S). Le tableau 1 indique l’âge du patient au moment du prélèvement sanguin et l’indication utilisée pour décider de l’analyse ultérieure. Trois des patients présentaient une cholestase néonatale comme manifestation initiale d’une hépatopathie chronique.

Le tableau 2 présente les taux sériques d’ALT, AP, gGT, A1AT ainsi que les résultats de l’étude moléculaire et de la biopsie hépatique.

Les cinq patients avec le génotype ZZ avaient des taux sériques d’A1AT réduits et la biopsie hépatique a montré une cirrhose (un), une hépatite néonatale (deux), une paucité des canaux biliaires interlobulaires (un) et une hépatite chronique (un). Dans ce dernier cas (FSP), des granules cytoplasmiques d’aspect éosinophile ont été observés dans les hépatocytes périportaux après coloration à l’HE et confirmés postérieurement par la positivité du PAS et la résistance à la diastase (Figure 1). Les deux patients atteints de cholestase néonatale (EKBA et RHBP) ont subi une biopsie hépatique lorsqu’ils étaient âgés de 10 semaines et 13 semaines, respectivement, et ont montré des globules éosinophiles PAS-positifs et résistants à la diastase.

Les figures 2 et 3 montrent les résultats de l’amplification et de la digestion des allèles S et Z, respectivement.

DISCUSSION

Le déficit en alpha-1-antitrypsine est l’une des maladies génétiques les plus courantes qui entraîne une maladie hépatique chez les enfants et c’est la maladie génétique la plus fréquente nécessitant une transplantation hépatique(17, 28). Le déficit en A1AT touche 1 nouveau-né sur 1600-2000 en Amérique du Nord et en Europe du Nord(28, 31), mais seulement 10-15% de la population présentant ce déficit développe des maladies hépatiques(32, 33). Selon une étude publiée par SVEGER en 1988(33), pendant la période néonatale, 11% des patients présentant le phénotype PIZZ développent une hépatite ictérique. Dans cette étude, trois patients diagnostiqués avec un déficit en A1AT ont présenté une cholestase néonatale et dans deux d’entre eux, avant que le diagnostic définitif du déficit ne soit établi, la cholestase a été considérée comme idiopathique. Cinq à 10 % des cas d’hépatite néonatale idiopathique rapportés dans la littérature sont causés par un déficit en A1AT(3).

Chez cinq patients étudiés présentant ce déficit, les taux sériques d’A1AT étaient inférieurs à la limite inférieure normale. Toutefois, ce test n’a pas permis de confirmer de manière absolue le diagnostic de la maladie. L’A1AT étant une protéine de la phase inflammatoire aiguë, sa synthèse augmente dans les états inflammatoires/infectieux, les néoplasies, la grossesse et pendant les traitements à base d’oestrogènes et de corticostéroïdes(16, 22). Une réduction des niveaux sériques d’A1AT se produit dans le syndrome d’angoisse respiratoire des nouveau-nés, dans la phase terminale de l’insuffisance hépatique, dans la mucoviscidose et dans les situations où il y a une grande perte de protéines(15). Les taux sériques des génotypes SZ, qui pourraient théoriquement entraîner des maladies hépatiques, sont généralement normaux.

Lorsqu’une cholestase néonatale est présente, il est fondamentalement nécessaire de faire un diagnostic différentiel avec une atrésie biliaire extrahépatique. L’histoire clinique permet un diagnostic adéquat dans 83% des cas(1) et il est nécessaire de réaliser des investigations spécifiques afin d’améliorer la précision du diagnostic. Parmi ces examens, la biopsie du foie est d’une importance majeure. Les altérations histopathologiques observées dans la biopsie du foie des patients présentant un déficit en A1AT peuvent être les mêmes que celles observées dans l’hépatite néonatale idiopathique ou dans les cas d’atrésie biliaire extrahépatique(24). La présence de globules intrahépatiques, principalement périportaux, fortement positifs au PAS après digestion par la diastase, est une indication utile du déficit en A1AT(13, 18, 27). Cependant, il est difficile d’identifier ces globules avant la 12e semaine après la naissance (35). Dans cette étude, le patient EKBA présentait des globules avec les caractéristiques ci-dessus dans le tissu hépatique à l’âge de 10 semaines. Aucun globule de ce type n’a été observé chez le patient JCI (âgé de 13 semaines). Ces résultats suggèrent que la présence de globules doit être recherchée par une coloration spéciale dans les fragments hépatiques obtenus avant l’âge de 12 semaines, bien qu’un résultat négatif n’élimine pas la possibilité d’un déficit en A1AT. L’analyse biochimique n’a pas été utilisée dans cette étude car l’analyse de l’ADN, plus précise, était possible.

Un déficit en A1AT est relativement fréquent chez les enfants qui présentent une maladie hépatique d’étiologie non définie. Ce diagnostic est sous-estimé, probablement parce que des méthodes de diagnostic imprécises sont utilisées. L’analyse moléculaire permet un diagnostic plus précis et peut également être utile pour le conseil génétique des patients atteints de maladie hépatique d’étiologie inconnue.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – La déficience en alfa-1-antitripsine est une maladie génétique transmise de façon autosomique co-dominante. Les principales manifestations cliniques comprennent l’acometimento pulmonaire et hépatique. Ce dernier se présente comme une colostase néonatale, une hépatite crônique ou une cirrose. Le diagnostic définitif est posé par une analyse biochimique de l’alpha-1-antitrypsine ou une analyse moléculaire. Objetivo – Investigar, em um grupo de 12 crianças com suspeita de deficiência de alfa-1-antitripsina, a presença efetiva da deficiência através da análise de DNA, para um diagnóstico definitivo, bem como a associação entre os deficientes de alfa-1-antitripsina com características clínicas e laboratoriais encontradas. Casuistique et méthodes – Les allèles mutants S et Z du gène de l’alpha-1-antitrypsine ont été étudiés chez 12 patients dont l’âge variait de 3 mois à 19 ans, envoyés par la clinique externe de gastroentérologie pédiatrique de l’Universidade Estadual de Campinas, SP, Brésil, pour avoir présenté des taux d’alpha-1-antitrypsine inférieurs à la normale et/ou une maladie hépatique sans étiologie définie. L’analyse de l’ADN a été réalisée à l’aide de la méthode modifiée d’amplification génique par réaction en chaîne par polymérase qui crée des sites de restriction pour les enzymes Xmnl (allèle S) et Taq l (allèle Z). Résultats – Sur les 12 patients référés, 7 présentaient une maladie hépatique chronique sans étiologie définie et les 5 autres avaient un faible dosage d’alpha-1-antitrypsine sérique accompagné d’un diagnostic de cholestase néonatale et/ou de maladie hépatique chronique d’étiologie inconnue. Dans ce groupe de 12 patients, on a observé cinq patients homozygotes Z (ZZ) et deux porteurs de l’allèle S accompagné d’un autre allèle, différent de Z (*S). Conclusion – Ces résultats montrent que le déficit en A1AT est une étiologie relativement fréquente chez les enfants présentant une maladie hépatique chronique sans étiologie définie et/ou un faible dosage d’A1AT sérique (41,6%). L’importance d’un diagnostic de certitude pour la déficience se justifie non seulement pour le suivi clinique du patient mais aussi, en termes de conseil génétique.

DESCRITORS ¾ Déficit en alpha-1-antitrypsine. Diagnostic moléculaire. Biopsie du foie.

1. Alagille D. Cholestase dans les trois premiers mois de la vie. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Two novel nonradioactive polymerase chain reaction-based assays of dried blood spots, genomic DNA, or whole cells for fast, reliable detection of Z and S mutations in the Alpha-1-antitrypsin gene. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Base moléculaire de la déficience en alpha-1-antitrypsine. Am J Med 1988;84:13-31.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. Les fragments de restriction d’ADN associés à l’alpha 1-antitrypsine indiquent une origine unique pour l’allèle de déficience PI Z. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Le gène de l’alpha 1-antitrypsine et ses mutations. Clinical consequences and strategies for therapy. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Déficit en alpha-1-antitrypsine causé par le gène alpha-1-antitrypsine Nullmattawa. Une mutation d’insertion rendant le gène de l’alpha-1-antitrypsine incapable de produire de l’alpha-1-antitrypsine. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Rapid DNA analysis of alpha 1-antitrypsin deficiency : application of an improved method for amplifying mutated gene sequence. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Caractéristiques histopathologiques de la maladie du foie dans le déficit en alpha 1-antitrypsine. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Electrophorèse sur gel en gradient dénaturant du gène de l’alpha 1-antitrypsine : application au diagnostic prénatal. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Serum enzyme inhibitor concentrations in the respiratory distress syndrome. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Morphologie hépatique dans les maladies métaboliques héréditaires. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Assignation du gène de l’alpha 1-antitrypsine et d’un gène lié à la séquence au chromossome 14 humain par hybridation moléculaire. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. The electrophoretic alpha-1-globulin pattern of serum in alpha-1-antitrypsin deficiency. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Effect of administration of a combined strogen-progestin contraceptive on the level of individual plasma proteins. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alpha 1-antitrypsine : moléculaire et le système Pi. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Détection rapide non radioactive de mutations dans le génome humain par amplification spécifique d’allèle. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Manifestations cliniques du déficit en alpha 1-antitrypsine. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP : Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas ; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Déficit en alpha-1-antitrypsine. High prevalence in the St. Louis area determined by direct population screening. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Liver disease in alpha 1-antitrypsin deficiency detected by screening of 200,000 infants. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. The natural history of liver disease in alpha 1-antitrypsin deficient children. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Maladie du foie dans l’enfance. Caractéristiques histologiques et relation avec le phénotype de l’alpha 1-antitrypsine. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Inhibiteurs de protéinase du plasma humain. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Déficience en alpha 1-antitrypsine : un aperçu. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Déficit de thérapie de remplacement associé à l’emphysème. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Étude réalisée par les départements de pédiatrie, de génétique médicale, de pathologie anatomique et de pathologie clinique de la faculté des sciences médicales (FCM), université d’État de Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brésil.

1 Étudiant de troisième cycle. Département de pédiatrie, FCM/UNICAMP.

2 Professeur adjoint. Département de pathologie clinique, FCM/UNICAMP.

3 Professeur adjoint. Département d’anatomie pathologique, FCM/UNICAMP.

4 Docteur en génétique (Institut de biologie), UNICAMP.

5 Professeur adjoint. Département de génétique médicale, FCM/UNICAMP.

6 Professeur adjoint. Département de pédiatrie, FCM/UNICAMP.