Comment mettre en place votre expérience d’élution

Qu’ont en commun les mini-préparations d’ADN et les expériences d’immunoprécipitation de protéines ? Elles commencent différemment, mais elles se terminent par la même étape critique : l’élution. Mais qu’est-ce que l’élution exactement, et à quoi cela sert-il ?

La terminologie

D’abord, commençons par une terminologie de base :

Elution – extraire une matière d’une autre par lavage avec un solvant.

L’adsorbant – une phase solide, qui peut être un gel de silice dans le cas des mini-colonnes de préparation, mais généralement des perles qui peuvent être liées de manière covalente à des anticorps ou à d’autres molécules ligands. « Phase solide » ne signifie pas nécessairement une colonne sur pied ; il peut s’agir de perles dans un eppendorf qui sont faciles à laver.

Affinité – une mesure de la capacité de l’absorbant à lier la molécule de choix (ce que vous essayez d’éluer). Plus l’affinité de la phase solide avec la biomolécule de choix (BOC) est élevée, plus la molécule s’y lie étroitement. Cependant, vous ne voulez pas que la liaison soit irréversible ; cela rendrait l’élution impossible.

Eluent – un solvant qui élimine la BOC de l’absorbant.

Eluat – le solvant contenant la BOC éliminée de l’adsorbant.

Préparation du matériel

Avant l’élution, vous devez absorber la molécule de choix tout en vous débarrassant de la contamination. C’est une étape essentielle, car la sagesse populaire nous rappelle « garbage in, garbage out ». Vous pouvez disposer d’excellents réactifs pour l’élution, mais si votre échantillon contient trop de personnel non apparenté (le terme scientifique est « gunk »), il obstruera le matériau d’adsorption. La saturation de la phase solide empêchera votre BOC d’absorber et contaminera ensuite l’éluat. Les étapes de lyse et de nettoyage efficaces sont essentielles pour le succès de votre expérience d’élution.

Il est important de déterminer le volume de votre matériau de pré-absorption. Le volume de lysat qui passe à travers le milieu d’absorption ne doit pas dépasser 3 à 5 volumes de la colonne. Le grand volume de lysat qui passe à travers l’absorbant augmente le temps de l’expérience, ainsi que la probabilité d’absorption de gunk. Dans de nombreux cas, il est intéressant de réduire le volume initial de lysat par filtration ou fractionnement. Ainsi, le volume du lysat détermine la taille de la colonne.

Le choix du matériau d’adsorption dépend de la composition chimique de votre molécule d’intérêt. L’absorption des biomolécules implique généralement une interaction plus ou moins spécifique entre le substrat et la molécule. Par exemple, l’ADN est absorbé sur les mini-colonnes en raison de l’interaction ionique entre les groupes phosphate de l’ADN chargés négativement et les particules de silice chargées positivement.

Les protéines sont généralement adsorbées sur du sépharose ou des billes magnétiques recouvertes d’IgG.

Après une application initiale de lysat, à aucun moment votre colonne ne peut sécher. Cela va « cuire votre » molécule sur l’absorbant et perturber l’intégrité de la colonne. Si vous n’avez pas le temps de poursuivre l’expérience, complétez la colonne avec un tampon compatible et arrêtez le flux.

Lavage

Le but du lavage de la phase solide est d’éliminer un matériau non apparenté, tout en laissant la molécule d’intérêt sur la colonne. La séparation sélective est souvent obtenue en utilisant un tampon à faible force ionique (par exemple, une faible concentration en sel). Le volume du tampon de lavage doit être proche de la quantité de matière initiale et représenter au moins 3 à 5 volumes de la colonne.

Cependant, après plusieurs volumes de tampon de lavage passés dans la colonne, les contaminations seront lavées et tout lavage supplémentaire n’améliorera pas la qualité de votre préparation. De plus, vous commencerez à perdre votre matériel cible.

Elution

Image : Chromatogramme montrant le profil d’absorption UV du surnageant d’Arabidopsis séparé sur Sephadex G-50 Superfine. Volume du gel : 500 mL ; longueur de la colonne : 700 mm ; diamètre de la colonne : 30 mm ; débit de l’éluant : 12 mL / hr ; volume des fractions : 8.0 mL ; nombre de fractions : 95 ; volume de l’échantillon : 5 mL ; température de séparation : 4 °C ; tampon d’élution : 20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3 ; pH 8,0. Crédit image : https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chrom_SephG-50.tif

L’élution elle-même fonctionne parce que vous perturbez les liaisons entre la colonne et le substrat (c’est-à-dire en utilisant un sel élevé ou une température élevée de l’éluant). L’élution se fait généralement dans un petit volume de tampon compatible avec le stockage de l’échantillon et les applications ultérieures.

L’élution de l’ADN à partir de la colonne mini-prep est le cas le plus simple : un volume de tampon élimine presque tout l’ADN. La concentration d’ADN dans l’éluat est inversement proportionnelle au tampon d’élution utilisé : plus on utilise de tampon, plus la concentration finale d’ADN est faible. Cependant, même dans ce cas, la plupart des fabricants recommandent d’utiliser un volume supplémentaire pour éliminer tout l’ADN.

Pour les colonnes, la vitesse d’élution est critique. Une vitesse trop lente augmentera les chances de dégradation de la molécule ; trop rapide et il n’y aura pas de résolution des fractions.

Pour les colonnes de grand volume, vous devez collecter des fractions d’éluat car votre molécule sera répartie entre elles. La première fraction contiendra un mélange de tampon de lavage et d’élution et une éventuelle contamination non éliminée par le tampon de lavage.

Vous pouvez surveiller la DO pour votre type de molécule (260nm/280nm pour l’ADN) et faire un blot pour la concentration de votre molécule spécifique dans chaque fraction. Dans le cas le plus simple, la distribution de votre molécule suivra une simple courbe en cloche, mais elle peut avoir un ou plusieurs pics aigus.

En conclusion, connaître les paramètres de base de votre expérience (absorbant, taille de la colonne, tampon de lavage, tampon d’élution, débit, nombre des fractions) et les principes généraux de l’élution vous permettra de mettre en place votre élution avec succès.

Pour plus de détails, trouvez un article où les autres scientifiques ont fait quelque chose de similaire – idéalement la même molécule, mais une similaire fera l’affaire – et adaptez à votre condition.