Choisir les enzymes de restriction appropriées en fonction de critères définis
Afin de procéder à un exemple concis, la protéine fluorescente tdTomato a été clonée dans un vecteur alpharétroviral. Par la suite, une lignée cellulaire de leucémie murine exprimant tdTomato a été générée. Cette lignée cellulaire sera utilisée pour suivre les cellules tumorales lors de leur injection à des souris dans le cadre d’études précliniques d’immunothérapie. Cependant, cette méthode de clonage est applicable à tout autre gène. Pour commencer le projet de clonage, le gène d’intérêt (GOI) doit être analysé. Tout d’abord, nous vérifions si notre séquence annotée possède un codon de départ (ATG, le codon de départ le plus courant) et l’un des trois codons d’arrêt (TAA, TAG, TGA). Dans le cas où le gène a été précédemment manipulé ou fusionné à un autre gène (par exemple via une séquence 2A), il arrive qu’un gène d’intérêt ne possède pas de codon stop. Dans ce cas, un codon stop doit être ajouté à la fin de votre séquence annotée. Il est également utile de vérifier si votre IGO contient un cadre de lecture ouvert (ORF). Ceci est important car la manipulation fréquente des séquences, que ce soit par logiciel ou par clonage, peut entraîner l’ajout ou la suppression de nucléotides par erreur. Nous utilisons le logiciel Clone Manager (SciEd) pour trouver les ORF dans nos séquences plasmidiques ; cependant, il existe plusieurs sites web gratuits que vous pouvez utiliser pour trouver des ORF, notamment le NCBI open reading frame finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
Le gène tdTomato contient un codon de départ ATG et un codon d’arrêt TAA (figure 1). La taille du gène tdTomato est de 716 pb.
Aperçu du début et de la fin du gène d’intérêt. (A) Les séquences nucléotidiques au début et à la fin du gène tdTomato sont présentées. Les nucléotides du brin codant sont spécifiés en gras. (B) Les séquences nucléotidiques des amorces avant et arrière contenant des sites d’enzymes de restriction appropriés et la séquence de Kozak sont indiquées.
Dans une étape suivante, les amorces PCR qui comprennent des sites d’enzymes de restriction appropriés doivent être conçues pour l’amplification du GOI. Plusieurs critères doivent être pris en compte afin de choisir les enzymes de restriction optimales. Tout d’abord, les sites de liaison pour les enzymes de restriction doivent être idéalement disponibles sur un site de clonage multiple dans le vecteur. Ils peuvent également être situés en aval du promoteur dans votre séquence de vecteur. Les enzymes de restriction doivent être des coupeurs simples (les coupeurs simples ne ciblent qu’un seul site de restriction dans une séquence d’ADN) (figure 2A). Si elles sont doubles ou multiples, elles doivent couper dans une séquence qui n’est pas nécessaire au bon fonctionnement du vecteur plasmidique et seront finalement éliminées (Figure 2B). Il est également possible de choisir une enzyme double ou multiple coupant le vecteur en aval du promoteur et également pas dans une séquence vitale du plasmide (Figure 2C). Les enzymes à double coupure ou à coupure multiple possèdent respectivement deux ou plusieurs sites de restriction sur une séquence d’ADN. Couper le vecteur avec des cutters doubles ou multiples donnerait lieu à deux extrémités identiques. Dans ce cas, la cassette d’insertion devrait également contenir les mêmes sites d’enzymes de restriction sur ses deux extrémités. Par conséquent, lorsque les fragments d’insert et de vecteur sont mélangés dans une expérience de ligature, l’insert peut fusionner au vecteur dans la bonne orientation (du codon de départ au codon d’arrêt) ou inversement (du codon d’arrêt au codon de départ). Un troisième scénario peut se produire, si le fragment de vecteur forme un cercle auto-ligaturant omettant totalement l’insert. Une fois l’ADN incubé avec les enzymes de restriction, la déphosphorylation des extrémités 5′ et 3′ du plasmide vecteur à l’aide d’une enzyme phosphatase alcaline réduira considérablement le risque d’auto-ligature. Il est donc important de cribler un produit de clonage pour ces trois produits (bonne orientation, orientation inverse, auto-ligature) après la ligature du fragment.
Choisir les enzymes de restriction appropriées en fonction de critères définis pour le clonage par PCR. (A) Deux enzymes de restriction à coupe unique (E1 et E2) sont situées en aval du promoteur. (B) Les enzymes de restriction E1 et E2 coupent le plasmide en aval du promoteur plusieurs fois (ici deux fois pour chaque enzyme). (C) L’enzyme de restriction E1 coupe le plasmide en aval du promoteur plus d’une fois. (D) Le produit de la PCR, qui contient le gène tdTomato et les sites des enzymes de restriction, a été passé sur un gel avant d’être extrait pour des applications en aval.
Deuxièmement, en raison d’une plus grande efficacité de clonage en utilisant des fragments d’ADN à extrémité collante, il est souhaitable qu’au moins une (mieux les deux) des enzymes de restriction soit ce qu’on appelle un coupeur d’extrémité collante. Les coupeurs d’extrémités collantes clivent l’ADN de manière asymétrique en générant des extrémités cohésives complémentaires. En revanche, les enzymes de restriction à extrémité émoussée coupent la séquence de manière symétrique, sans laisser de surplomb. Le clonage de fragments à extrémité émoussée est plus difficile. Néanmoins, le choix d’un rapport molaire insert/vecteur plus élevé (5 ou plus) et l’utilisation de 10% de polyéthylène glycol (PEG) peuvent améliorer la ligature des fragments à extrémité émoussée.
Troisièmement, certaines enzymes de restriction ne coupent pas l’ADN méthylé. La plupart des souches d’E. coli contiennent des méthylases Dam ou Dcm qui méthylent les séquences d’ADN. Cela les rend résistantes aux enzymes de restriction sensibles à la méthylation. Comme l’ADN du vecteur est principalement préparé dans E. coli, il sera méthylé. Il est donc souhaitable d’éviter les enzymes de restriction sensibles à la méthylation ; cependant, il arrive que l’isoschizomère d’une enzyme de restriction sensible à la méthylation soit résistant à la méthylation. Par exemple, l’enzyme Acc65I est sensible alors que son isoschizomère kpnI est résistant à la méthylation. Les isoschizomères sont des enzymes de restriction qui reconnaissent les mêmes séquences nucléotidiques. S’il ne reste aucune autre option que l’utilisation d’enzymes de restriction sensibles à la méthylation, l’ADN du vecteur doit être préparé dans des souches dam – dcm – E. coli. Une liste de ces souches ainsi que des souches hôtes E. coli courantes pour le clonage moléculaire est résumée dans le tableau 1. Les informations concernant la sensibilité à la méthylation des enzymes de restriction sont généralement fournies par le fabricant.
Quatrièmement, cela facilite le clonage si le tampon nécessaire à la pleine fonctionnalité des enzymes de restriction est le même car on peut effectuer une double digestion de restriction. Cela permet de gagner du temps et de réduire la perte d’ADN pendant la purification. Il peut arriver qu’une des enzymes de restriction soit active dans un tampon et que la seconde enzyme soit active dans une concentration double du même tampon. Par exemple, l’enzyme NheI de Thermo Scientific est active dans le tampon Tango 1X (Thermo Scientific) et l’enzyme EcoR1 est active dans le tampon Tango 2X (Thermo Scientific). Dans ce cas, l’ADN plasmidique doit d’abord être digéré par l’enzyme nécessitant la concentration de tampon la plus élevée (ici EcoR1). Cette étape sera suivie d’une dilution du tampon pour l’enzyme suivante (nécessitant une concentration inférieure (ici NheI)) dans le même tampon. Cependant, l’apparition de tampons universels a simplifié la double digestion des séquences d’ADN. Dans notre exemple, le vecteur contient les sites de restriction AgeI et SalI. Ces sites enzymatiques ont été utilisés pour concevoir les amorces PCR (Figure 1). Il est essentiel pour une bonne digestion par les enzymes de restriction que la pureté du plasmide soit élevée. L’absorbance de l’ADN mesurée par un spectrophotomètre peut être utilisée pour déterminer la pureté après purification. L’ADN, les protéines et les solvants absorbent à 260 nm, 280 nm et 230 nm, respectivement. Un rapport OD 260/280 de >1,8 et un rapport OD 260/230 de 2 à 2,2 sont considérés comme purs pour les échantillons d’ADN. Les rapports OD 260/280 et 260/230 de nos préparations plasmidiques exemplaires étaient respectivement de 1,89 et 2,22. Nous avons observé que la pureté des fragments d’ADN de vecteur et d’insert extraits sur gel était plus faible après la digestion de restriction ; la ligature fonctionne même dans de tels cas, cependant, de meilleurs résultats peuvent être attendus en utilisant des fragments de haute pureté.
Le site web de dépôt de plasmides suivant peut être utile pour la sélection de différents vecteurs (expression et conditionnement viraux, backbones vides, protéines fluorescentes, vecteurs inductibles, étiquettes épitopes, protéines de fusion, gènes rapporteurs, systèmes d’expression spécifiques à une espèce, marqueurs de sélection, promoteurs, expression shRNA et ingénierie des génomes):http://www.addgene.org/browse/.
Une collection de vecteurs de clonage d’E. coli est disponible sous le site web suivant:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Conception d’amorces de clonage sur la base de critères définis
Pour la conception d’amorces PCR, vérifiez les codons de départ et d’arrêt de votre GOI. Trouvez la séquence des enzymes de restriction souhaitées (disponible sur les sites web des fabricants) pour l’amorce avant (figure 3A). Elle doit être située avant le GOI (Figure 1B). La séquence dite de Kozak se trouve dans les ARNm eucaryotes et améliore l’initiation de la traduction. Il est bénéfique d’ajouter la séquence Kozak (GCCACC) avant le codon d’initiation ATG car elle augmente la traduction et l’expression de la protéine d’intérêt chez les eucaryotes. Par conséquent, nous avons inséré GCCACC immédiatement après la séquence de l’enzyme de restriction AgeI et avant le codon d’initiation ATG. Ensuite, les 18 à 30 premiers nucléotides de l’IGO à partir du codon d’initiation ATG sont ajoutés à la séquence d’amorce avant. Ces nucléotides chevauchants qui se lient à l’ADN matrice déterminent la température d’hybridation (Tm). Cette dernière est généralement supérieure à 60°C. Ici, nous utilisons l’ADN polymérase haute fidélité Phusion (Thermo Scientific). Vous pouvez utiliser les sites web suivants pour déterminer la Tm optimale :http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Conception d’amorces basées sur des critères définis pour le clonage par PCR. (A-B) Les séquences de l’amorce directe et de l’amorce inverse sont représentées. L’extrémité du brin codant doit être convertie en format de complément inverse pour la conception de l’amorce inverse. Pour plus d’informations, veuillez consulter le texte.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Le Tm de notre amorce avant est de 66°C.
Choisissez les 18 à 30 derniers nucléotides incluant le codon stop de votre IGO pour concevoir l’amorce inverse (Figure 3B). Calculez ensuite le Tm de cette séquence qui doit être supérieur à 60°C et proche du Tm de l’amorce avant. Le Tm de la séquence chevauchante de notre amorce inverse était de 68°C. Ensuite, ajoutez la séquence cible du second site d’enzyme de restriction (dans ce cas SalI) immédiatement après le codon stop. Enfin, convertissez cette séquence assemblée en une séquence à complémentation inverse. Les sites Internet suivants peuvent être utilisés pour déterminer la séquence de l’amorce inverse :
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis est importante car l’amorce inverse se lie au brin codant et donc sa séquence (5′ → 3′) doit être complémentaire inverse de la séquence du brin codant (Figure 1A).
Réaliser une PCR en utilisant des polymérases à relecture
Puisque la réaction de PCR suit une amplification logarithmique de la séquence cible, toute erreur de réplication durant ce processus sera amplifiée. Le taux d’erreur des ADN polymérases sans relecture, comme la Taq polymérase, est d’environ 8 × 10-6 erreurs/bp/cycle PCR ; cependant, les enzymes de relecture comme la Phusion polymérase ont un taux d’erreur rapporté de 4,4 × 10-7 erreurs/bp/cycle PCR. En raison de sa fidélité et de sa processivité supérieures, l’ADN polymérase de Phusion a été utilisée dans cet exemple. Il convient de noter que Phusion a des exigences de température différentes de celles des autres ADN polymérases. Le Tm de l’amorce pour Phusion est calculé sur la base de la méthode de Breslauer et est plus élevé que le Tm utilisant les polymérases Taq ou pfu. Pour obtenir des résultats optimaux, le Tm doit être calculé sur la base des informations trouvées sur le site Web des fournisseurs d’enzymes. En outre, en raison de la vitesse plus élevée de Phusion, 15 à 30 secondes sont généralement suffisantes pour l’amplification de chaque kb de la séquence d’intérêt.
Après la PCR, le produit doit être chargé sur un gel (figure 2D). La bande correspondante doit être coupée et l’ADN extrait. Il est essentiel de séquencer le produit de la PCR car celui-ci peut comporter des mutations. Il existe plusieurs kits de clonage PCR disponibles, dont certains sont présentés dans le tableau 2. Nous avons utilisé le vecteur de clonage pJET1.2/blunt (Thermo Scientific, publication du brevet : US 2009/0042249 A1, numéro d’accession Genbank EF694056.1) et cloné le produit PCR dans le vecteur linéarisé. Ce vecteur contient un gène létal (eco47IR) qui est activé au cas où le vecteur se circularise. Cependant, si le produit de la PCR est cloné dans le site de clonage à l’intérieur du gène létal, ce dernier est perturbé, permettant aux bactéries de développer des colonies lors de la transformation. Les vecteurs circularisés ne contenant pas le produit PCR expriment le gène toxique, qui tue donc les bactéries en empêchant la formation de colonies. Les clones bactériens sont ensuite mis en culture, l’ADN plasmidique est isolé consécutivement et séquencé. La qualité du plasmide isolé est essentielle pour obtenir des résultats de séquençage optimaux. Nous avons isolé l’ADN plasmidique d’un total de 1,5 ml de bactéries cultivées (rendement de 6 μg d’ADN ; DO 260/280 = 1,86 ; DO 260/230 = 2,17) à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide (QIAGEN). L’ensemble du processus de PCR, y compris le clonage du produit de PCR dans le vecteur de séquençage et la transfection des bactéries avec le vecteur de séquençage, peut être réalisé en une journée. Le lendemain, les clones bactériens seront cultivés pendant la nuit avant d’être envoyés pour le séquençage.
Analyse des données de séquençage
Les sociétés de séquençage rapportent normalement les données de séquençage sous forme de fichier FASTA et également sous forme de séquences nucléotidiques prêtes par courriel. Pour l’analyse des séquences, les sites web suivants peuvent être utilisés :
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Nous allons ici nous concentrer sur le premier site web. Sur la page de ce site web, cliquez sur l’option « nucleotide blast » (figure 4A). Une nouvelle fenêtre s’ouvre. Par défaut, l’option « blastn » (blast de séquences nucléotidiques) est cochée (Figure 4B). Cochez ensuite la case derrière « Aligner deux ou plusieurs séquences ». Deux cases apparaissent alors. Dans la boîte « Enter Query Sequence » (la boîte supérieure), insérez la séquence désirée de votre gène d’intérêt, qui est flanquée par les sites de restriction que vous avez déjà conçus pour vos amorces PCR. Dans la case « Enter Subject Sequence » (la case inférieure), entrez la séquence ou téléchargez le fichier FASTA que vous avez reçu de la société de séquençage. Cliquez ensuite sur le bouton « BLAST » en bas de la page. Après quelques secondes, les résultats seront affichés sur une autre page. Une partie des données d’alignement est présentée dans la Figure 4C. Pour l’interprétation, les points suivants doivent être pris en compte : 1) le nombre de nucléotides identiques (indiqué sous la rubrique « Identities ») doit être égal au nombre de nucléotides de votre gène d’intérêt. Dans notre exemple, le nombre de nucléotides du gène tdTomato ainsi que ceux des sites d’enzymes de restriction et de la séquence de Kozak était de 735. Ce chiffre est égal au nombre rapporté (Figure 4C). 2) L’identité de séquence (sous la rubrique « Identités ») doit être de 100 %. Parfois, l’identité de la séquence est de 100% mais le nombre de nucléotides identiques est plus faible que prévu. Cela peut se produire si un ou plusieurs des nucléotides initiaux sont absents. N’oubliez pas que toutes les technologies de séquençage ont un taux d’erreur. Pour le séquençage Sanger, ce taux d’erreur serait compris entre 0,001 % et 1 %. La substitution, la délétion ou l’insertion de nucléotides peuvent être identifiées en analysant les résultats du séquençage. Par conséquent, si l’identité de séquence n’atteint pas 100%, le plasmide doit être reséquencé afin de différencier les erreurs de la PCR des simples erreurs de séquençage. 3) Les lacunes (sous la rubrique « Lacunes ») ne doivent pas être présentes. Si des lacunes apparaissent, le plasmide doit être reséquencé.
Analyse de la séquence du produit PCR en utilisant la plateforme NCBI BLAST. (A) Sur la page web de NCBI BLAST, l’option » nucleotide blast » est choisie (marquée par la ligne ovale). (B) L’option « blastn » apparaît par défaut (marquée par le cercle). La séquence du gène d’intérêt (flanquée des sites de restriction tels que conçus précédemment pour les amorces PCR) et le produit PCR doivent être insérés dans les cases « Enter Query Sequence » et « Enter Subject Sequence ». Les séquences peuvent également être téléchargées sous forme de fichiers FASTA. (C) L’alignement des nucléotides des 60 premiers nucléotides est montré. Deux éléments importants pour l’analyse de la séquence sont marqués par des lignes ovales.
La longueur moyenne d’une lecture, ou longueur de lecture, est d’au moins 800 à 900 nucléotides pour le séquençage Sanger. Pour le vecteur pJET, une amorce avant et une amorce inverse doivent être utilisées pour le séquençage du gène complet. Ces amorces peuvent normalement couvrir une taille de gène allant jusqu’à 1800 pb. Si la taille d’un gène est supérieure à 1800, une amorce supplémentaire doit être conçue pour chaque 800 nucléotides supplémentaires. Étant donné que l’appel de base fiable ne commence pas immédiatement après l’amorce, mais environ 45 à 55 nucléotides en aval de l’amorce, l’amorce suivante doit être conçue pour commencer après environ 700 nucléotides du début du gène. Différents sites web, dont les suivants, peuvent être utilisés pour concevoir ces amorces :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Etant d’une longueur de 735 pb, la taille du produit PCR dans cet exemple était bien dans la gamme des amorces de séquençage pJET.
Après avoir choisi le clone à séquence vérifiée, les plasmides vecteur et insert ont été digérés par les enzymes de restriction AgeI et SalI (figure 5). Cette opération a été suivie d’une purification sur gel et d’une ligature des fragments. La transformation d’E. coli compétent avec le mélange de ligature a donné plusieurs clones qui ont été criblés par les enzymes de restriction. Nous avons évalué huit clones, qui contenaient tous l’insert tdTomato (Figure 6). Il est important de choisir des clones de grande taille. Les clones satellites pourraient ne pas avoir la bonne construction. Nous avons utilisé un kit de mini-préparation rapide de plasmide (Zymo Research) pour extraire le plasmide de 0,6 ml de suspension bactérienne. Le rendement et la pureté étaient satisfaisants pour le criblage par enzymes de restriction (2,3 μg d’ADN ; DO 260/280 = 1,82 ; DO 260/230 = 1,41). Pour la purification du plasmide à grande échelle, un kit de maxi préparation (QIAGEN) a été utilisé pour extraire le plasmide de 450 ml de culture bactérienne (rendement 787 μg d’ADN ; DO 260/280 = 1,89 ; DO 260/230 = 2,22). Le rendement attendu d’un isolement de plasmide dérivé de pBR322 à partir de 1,5 ml et 500 ml de culture bactérienne est d’environ 2-5 μg et 500-4000 μg d’ADN, respectivement.
Cartes de vecteurs et de plasmides d’insertion A) Illustration du plasmide CloneJET contenant le produit PCR. L’insertion du produit PCR dans le site de clonage du plasmide perturbe l’intégrité du gène toxique eco47IR et permet la croissance de clones positifs au transgène. Le plasmide a été coupé avec les enzymes AgeI et SalI générant deux fragments de 3 kb et 0,7 kb. Le fragment de 0,7 kb (gène tdTomato) a été utilisé comme insert pour le clonage. (B) Illustration du plasmide vecteur. Le plasmide a été coupé avec les enzymes AgeI et SalI, générant deux fragments de 4,9 kb et 0,7 kb. Le fragment de 4,9 kb a été utilisé comme vecteur pour le clonage. AMP : Gène de résistance à l’ampicilline ; PRE : élément régulateur posttranscriptionnel ; MPSV : promoteur du virus du sarcome myéloprolifératif.
Criblage du plasmide final avec les enzymes de restriction. L’illustration du plasmide final est présentée. Pour le criblage, le plasmide a été coupé avec l’enzyme BsiwI générant deux fragments de 4,8 kb et 0,8 kb de taille. AMP : Gène de résistance à l’ampicilline ; PRE : élément régulateur posttranscriptionnel ; MPSV : promoteur du virus du sarcome myéloprolifératif.
Certains plasmides ont tendance à se recombiner à l’intérieur de l’hôte bactérien créant des insertions, des délétions et des recombinaisons. Dans ces cas, l’utilisation d’un E. coli déficient en recA peut être utile (tableau 1). En outre, si le GOI est toxique, l’incubation des bactéries à des températures plus basses (25-30°C) et l’utilisation de souches ABLE C ou ABLE K pourraient contourner le problème.
Pour étudier l’expression in vitro du gène cloné, des cellules HEK293T ont été transfectées avec des plasmides codant le gène tdTomato, le Gag/Pol alpharétroviral et l’enveloppe de la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG). Ces cellules, qui sont dérivées du rein embryonnaire humain, sont faciles à cultiver et à transfecter. Elles sont donc largement utilisées en biotechnologie et en thérapie génique pour générer des particules virales. Les cellules HEK293T doivent être divisées tous les deux jours en utilisant un milieu chaud. Elles ne doivent pas atteindre 100% de confluence pour des résultats optimaux. Pour avoir une bonne efficacité de transfection, ces cellules doivent être cultivées pendant au moins une semaine pour les avoir en phase logarithmique. L’efficacité de la transfection était de 22 %, déterminée sur la base de l’expression du tdTomato par microscopie à fluorescence 24 heures plus tard (Figure 7A-B). Pour générer une lignée cellulaire de leucémie murine exprimant le gène tdTomato pour des études d’immunothérapie, des cellules leucémiques C1498 ont été transduites avec le virus fraîchement récolté (36 heures de transfection). Des études d’imagerie (figure 7C) et une analyse cytométrique de flux (figure 7D) quatre jours après la transduction ont confirmé l’expression de tdTomato dans la majorité des cellules.
Évaluation de l’expression in vitro du gène cloné. (A, B) Les cellules HEK293T ont été transfectées avec les plasmides Gag/Pol, VSVG et tdTomato. L’expression du gène tdTomato a été évaluée à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les images fluorescentes ont été superposées à une image en champ clair pour la différenciation des cellules transfectées positivement. L’efficacité de la transfection a été déterminée sur la base de l’expression de tdTomato après 24 heures. Les cellules HEK293T non transfectées ont été utilisées comme témoins (histogramme bleu). (C, D) La lignée cellulaire de leucémie murine C1498 a été transduite avec du virus frais. Quatre jours plus tard, l’expression du transgène a été évaluée par microscopie à fluorescence (C) et cytométrie de flux (D). Les cellules C1498 non transduites ont été utilisées comme témoins (histogramme bleu). Les barres d’échelle représentent 30 μm.
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