Trp53-nolla- ja R270H-mutanttialleleilla on vertailukelpoiset vaikutukset invaasion, metastaasin ja geeniekspression säätelyyn hiiren paksusuolen kasvainten synnyssä

Missense- ja nollatransaktiomutaatiot edistävät hiiren paksusuolen kasvainten etenemistä CDX2P-CreER T2 Apc fl/+ , Kras LSL-G12D (AK) -hiirissä

Kehittääksemme hiiren paksusuolen kasvainmallin, jota käynnistävät geenivirheet, jollaisia esiintyy usein ihmisen paksusuolen kasvaimissa, loimme yhdistelmämutaatiohiiriä, jotka kantavat yhtä floxed Apc-alleelia (Apcflox, 580S, lyhenne A), joka voitiin inaktivoida Cre-rekombinaasitoiminnalla, ja floxed, latentisti onkogeenisen Kras-alleelin (KrasLSL-G12D, lyhenne K), joka voitiin aktivoida Cre-rekombinaatiolla. Käyttämällä CDX2P-CreERT2-transgeeniä ja TAM-käsittelyä Cre-toiminnan aktivoimiseksi paksusuolen epiteelisoluissa kohdistimme Apc- ja Kras-alleelit distaalisen ileumin, cecumin ja paksusuolen epiteelissä. Kun CDX2P-CreERT2 K -hiirillä oli serratoitunut ja hyperplastinen paksusuolen epiteeli, CDX2P-CreERT2AK (AK) -hiirillä oli serratoitunut ja hyperplastinen paksusuolen epiteeli, ja niille kehittyi lisäksi keskimäärin 13 adenoomaa, joiden koko vaihteli 0,5 mm:stä 2 mm:iin, kun hiirten inhimilliset päätetapahtumat saatiin päätökseen 10 – 15 kk:n kuluttua TAM-käsittelyn päättymisestä (kuva 1a). Kuudella 10:stä AK-hiirestä havaittiin yksi tai kaksi adenokarsinoomaa, jotka olivat syntyneet paksusuolessa. Tutkituissa 10 AK-hiiressä havaituista yhteensä kahdeksasta adenokarsinoomasta seitsemän kasvainta tunkeutui muscularis propriaan (MP) tai syvemmälle ja viisi ulottui sub-serosaan tai serosaan (kuva 1b, taulukko 1 ja lisätaulukko 1). Koska kuitenkin vain 8 AK-hiirten 131 havaitusta kasvaimesta oli invasiivisia, havainnot viittaavat siihen, että invasiivisten paksusuolen kasvainten kehittyminen AK-hiirissä edellytti Apc- ja Kras-mutaatioiden lisäksi muita somaattisia vikoja.

Missense- ja nollatrp53-mutaatiot edistävät hiiren paksusuolen kasvainten etenemistä CDX2P-CreERT2 Apcfl/+-, KrasLSL-G12D (AK) -hiirissä. a Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrät CDX2P-CreERT2AK (AK) -hiiristä (n = 10, eloonjäämisen mediaani = 336 päivää), CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+) -hiiristä (n = 16, eloonjäämisen mediaani = 166 päivää), CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl) hiiret (n = 16, elossaolon mediaani = 97 päivää) ja CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl) hiiret (n = 20, elossaolon mediaani = 88 päivää). TAM-valmistetta annettiin päivittäin kahden päivän ajan, ja aika nolla edustaa toista näistä päivistä. P-arvot saatiin log-rank-testillä seuraavissa vertailuissa: P = 1,4E-6 AK vs. AKP270/+; P = 1,4E-7 AKPfl/fl vs. AKP270/+; P = 1,9E-8 AKP270/fl vs. AKP270/+. b Niiden paksusuolen kasvainten prosenttiosuus, joissa oli eri syvyydellä invaasiota AK-hiiristä, AKP270/+-hiiristä, AKPfl/fl-hiiristä ja AKP270/fl-hiiristä. Tiedot ovat useista vaurioista hiirtä kohti (n = 10-14 hiirtä ryhmää kohti). P-arvot, jotka perustuvat Fisherin Exact-testeihin ja Exact Poisson -testeihin, on esitetty taulukossa 1 ja lisätaulukossa 1. Virhepalkit ovat keskiarvon keskivirhe. A adenooma, SM submucosa, MP muscularis propria, SS subserosa, S serosa. c, d Hematoksyliini- ja eosiinivärjäykset (H&E) edustavista invasiivisista kasvaimista paksusuolen proksimaalisesta kudoksesta (oikealla) ja paksusuolessa (vasemmalla) on esitetty AKP270/fl-hiirillä (c) ja AKPfl/fl-hiirillä (d). Kuvien (c) ja (d) kasvaimet kerättiin 3 kuukautta TAM-injektion jälkeen. Kuvat, joissa on suuri suurennos, näkyvät alimmissa paneeleissa, ja ne on rajattu laatikkoon vastaavissa ylimmissä paneeleissa pienemmällä suurennoksella varustetuilla alueilla. Katkoviivat osoittavat lihaskerroksen ja subserosan välisen rajan. Mittakaavapalkit: 500 μm pienellä suurennoksella otetussa kuvassa (yläpaneelit); 100 μm suurennetuissa kuvissa (alimmat paneelit)

Kuten edellä todettiin, TP53-mutaatioita esiintyy noin 60 %:ssa ihmisen paksusuolen karsinoomista, ja ne näyttäisivät valikoituvan adenooma-karsinooman etenemisen aikana . Pyrimme arvioimaan Trp53:n inaktivaation yhteistyötä Apc- ja Kras-mutaatioiden kanssa paksusuolen kasvaimen etenemisessä in vivo sekä määrittämään, voidaanko Trp53:n missense-mutanttialleelin mahdolliset GOF-vaikutukset nähdä mallissa. Lisäsimme AK-malliin konstitutiivisen Trp53R270H-mutanttialleelin (ihmisen R273H:ta vastaava hiiren vastine, jäljempänä P270) ja/tai ehdollisen nolla-alleelin Trp53flox (jäljempänä Pfl). Muodostettiin hiiriä, joilla oli yhdistetyt genotyypit, ja niiden lyhenteet ovat seuraavat: CDX2P-CreERT2AKP270/+ (AKP270/+-hiiret), CDX2P-CreERT2AKP270/fl (AKP270/fl-hiiret) ja CDX2P-CreERT2AKPfl/fl (AKPfl/fl-hiiret). Aikuisten AKP270/+-, AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirten kohortit indusoitiin paksusuolen kasvaimille TAM-hoidon avulla ja niiden terveydentilaa seurattiin. Verrattuna AK-hiiriin (elossaoloajan mediaani = 336 päivää) AKP270/+, AKP270/fl ja AKPfl/fl-hiirten elinaika lyheni merkittävästi. AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirten elinaikojen mediaanit olivat 88 ja 97 päivää, ja AKP270/+-hiirten elinaikojen mediaani oli 166 päivää (kuva 1a). AKP270/+-hiirillä oli merkitsevästi pidempi elossaoloaika kuin AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirillä (P < 0,0001 kummallakin verrattuna AKP270/+-hiiriin), mutta tilastollisesti merkitsevää elossaoloaikojen eroa ei havaittu verrattaessa AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiiriä toisiinsa (kuva 1a). Trp53-mutaation (mutaatioiden) (R270H tai nolla) lisääminen lisäsi merkittävästi kasvainten kokonaisesiintyvyyttä AK-hiiriin verrattuna (P < 0,0001 sekä AKPfl/fl- että AKP270/fl-hiirille verrattuna AK-hiiriin, lisätaulukko 1 alhaalla vasemmalla). AKP-hiirillä oli myös useita paksu- ja pohjukaissuolen kasvaimia, joissa ilmeni invasiivisia piirteitä (7,3 ja 8,9 invasiivista kasvainta hiirtä kohti AKPfl/fl-hiirillä ja AKP270/fl-hiirillä vastaavasti) verrattuna AK-hiiriin (0,8 invasiivista kasvainta hiirtä kohti; Kuva 1b ja Täydentävä taulukko 1 ylhäällä oikealla, P < 0,0001 molemmilla AKPfl/fl vs. AKP270/fl-hiirillä). AK- ja AKP270/fl vs. AK-vertailuissa).

Nekropsiassa saatujen hiirten cecum- ja paksusuolen kudosten syvällinen analyysi määritteli laajan kasvainrasituksen AKP270/+-, AKPfl/fl- ja AKP270/fl-hiirillä, ja leesiot vaihtelivat adenoomista myöhäisvaiheen adenokarsinoomiin (Kuva 1b-d ja Taulukko 1). Kaikilla tutkituilla AKP270/+-, AKPfl/fl- ja AKP270/fl-hiirillä oli vähintään yksi adenokarsinooma (kasvain, jossa oli submucosaan tai syvemmälle tunkeutuneita kasvaimia). Sekä AKP270/fl- että AKPfl/fl-hiirten cecum- ja proksimaalisen paksusuolen alueilla todettiin merkkejä invaasiosta sileään lihakseen ja joissakin tapauksissa seroosaan (kuva 1c, d). AKP270/+-hiirillä, joiden Cre-kohdennetuissa epiteelisoluissa säilyi alun perin yksi toimiva villityyppinen Trp53-alleeli, oli pidempi latenssiaika kasvaimen kehittymiselle ja kasvainten kokonaiskuormitus (18,5 hiirtä kohti) ja niiden kasvainten prosenttiosuudet, joissa oli syvempi invaasio (11.9 %) olivat merkittävästi pienempiä verrattuna AKP270/fl- tai AKPfl/fl-hiiriin (lisätaulukko 1 ja taulukko 1, P < 0,01 verrattuna AKP270/fl- tai AKPfl/fl-hiiriin kasvaintaakan osalta hiirtä kohti ja adenokarsinoomien prosenttiosuudet). Nämä havainnot tukevat käsitystä siitä, että villityyppisellä p53:lla on kasvainsuppressoritoiminto paksusuolen kasvainten synnyssä myös Trp53:n missense-mutaatioalleelin yhteydessä. Kun kaikkia havaittuja kasvaimia verrattiin AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirten välillä, havaitsimme, että niiden adenokarsinoomien osuus, joissa oli submukoosaan tai syvemmälle ulottuva invaasio, oli suurempi AKP270/fl-hiirillä kuin AKPfl/fl-hiirillä (36,9 %:lla ja 26,1 %:lla AKP270/fl- ja 26,1 %:lla AKPfl/fl-hiirillä, vastaavasti; taulukko 1, P = 0,0026), mikä viittaa siihen, että R270H:n R270H-alkuisen Trp53:n alleelilla on mahdollisesti kohtalainen GOF-vaikutus, kun se lisää kudosinvasiota. AKP270/fl-hiirten invaasiopotentiaalin vaatimaton lisääntyminen saattaa kuitenkin kompensoitua, koska keskimääräinen kasvainkuorma hiirtä kohti oli AKPfl/fl-hiirillä yleensä korkeampi kuin AKP270/fl-hiirillä (28,0 vs. 24,2 hiirtä kohti, P = 0.054; lisätaulukko 1), eikä AKPfl/fl- ja AKP270/fl-hiirillä ollut merkittäviä eroja adenokarsinoomien esiintyvyydessä (7,3 vs. 8,9 adenokarsinoomaa hiirtä kohti, lisätaulukko 1 oikealla ylhäällä, P = 0,16). Lisäksi sekä AKP270/fl- että AKPfl/fl-hiirillä havaittiin joidenkin kasvainten tunkeutumista muscularis propriaan, subserosaan tai serosaan (kuva 1b ja taulukko 1). Koska vain noin 30 prosenttia AKP270/fl- tai AKPfl/fl-hiirten kasvaimista eteni adenokarsinoomiksi tutkimusjakson aikana, Apc-, Kras- ja Trp53-virheiden lisäksi muut somaattiset muutokset ovat todennäköisesti kriittisiä AKP-hiirten karsinoomien synnyssä.

Kasvaimen histologia ja etäpesäkkeet AKP270/fl- tai AKPfl/fl-hiirillä

Kullekin AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirille kehittyi yksi tai useampi adenokarsinooma siihen mennessä, kun humaanit päätepisteet saavutettiin. AKP270/fl-hiirillä yli 80 prosentissa adenokarsinoomista oli hyvin tai kohtalaisesti erilaistuneita piirteitä, ja niissä oli kasvaimen nuppuuntumista/versoontumista invaasiorintamalla ja satunnaista limasiinin eritystä (kuva 2a, yläosa). Noin 15-20 prosenttia AKP270/fl-adenokarsinoomista oli huonosti erilaistuneita, ja niillä oli trabekulaarinen, kiinteä morfologia (kuva 2a, keskellä). AKP270/fl-hiirillä havaittiin harvinaisia merkkirengassolusyöpiä (kuva 2a, alhaalla). AKPfl/fl-hiirillä noin 50 % adenokarsinoomista oli hyvin tai kohtalaisesti erilaistuneita ja erittivät mukiinia (kuva 2b, ylhäällä); loput olivat huonosti erilaistuneita (kuva 2b, alhaalla). Invasiivisissa AKP270/fl- ja AKPfl/fl-kasvaimissa havaittiin voimakasta β-kateniinin ydin- ja sytoplasmavärjäytymistä (kuva 2, keskellä), mikä on johdonmukaista Apc:n inaktivaatiosta johtuvan viallisen Wnt-signalisaation kanssa. AKP270/fl-kasvainsoluissa havaittiin voimakasta p53:n ydinvärjäytymistä. AKPfl/fl-kasvainsoluissa ei odotetusti havaittu p53-värjäytymistä (kuva 2, oikealla).

P53-mutanttihiirten paksusuolen adenokarsinoomien histologiset tyypit. H&E-värjäykset (vasemmanpuoleiset paneelit) ja immunohistokemialliset värjäykset β-kateniinille (keskimmäiset paneelit) ja p53:lle (oikeanpuoleiset paneelit) on esitetty riippumattomista paksusuolen kasvaimista, jotka ovat edustavia histologisia tyyppejä AKP270/fl-hiiriltä (a) ja AKPfl/fl-hiiriltä (b). Kasvaimet kerättiin 3 kuukautta TAM-induktion jälkeen. Mittakaavapalkit: 50 μm

Nekropsiassa imusolmukemetastaaseja todettiin 3:lla 13:sta AKPfl/fl-hiirestä ja 5:llä 14:stä AKP270/fl-hiirestä (taulukko 2). Niistä kolmesta AKPfl/fl-hiirestä, joilla kullakin oli etäpesäke vatsaontelon imusolmukkeessa, yhdellä hiirellä oli myös useita etäpesäkkeitä keuhkoissa ja toisella hiirellä useita etäpesäkkeitä maksassa (taulukko 2). Niistä viidestä AKP270/fl-hiirestä, joilla kullakin oli etäpesäke vatsaontelon imusolmukkeeseen, yhdellä hiirellä oli useita etäpesäkkeitä keuhkoihin ja toisella oli etäpesäkkeitä sekä keuhkoissa että maksassa (taulukko 2). AK- tai AKP270/+-hiirillä ei havaittu etäpesäkkeitä (taulukko 2). Tietomme osoittavat, että hiiren CRC-taudit, joissa on Trp53:n missense- tai null-mutaatioita, voivat synnyttää spontaaneja imusolmuke- ja etämetastaaseja vertailukelpoisella taajuudella, mikä osoittaa, ettei trp53:n missense-mutaatioilla ole GOF-vaikutusta metastaasien syntymiseen hiiren CRC-mallissamme.

Epiteeli-mesenkymaalinen siirtymä metastasoituvissa CRC-taudeissa, joissa on missense- tai null-Trp53

Yksittäisissä imusolmukkeisiin etäpesäkkeitä, joita löytyi kustakin viidestä eri AKP270/fl-hiirestä, neljässä leesiossa esiintyi kohtalaisesti erilaistunutta adenokarsinoomaa ja yksi leesio oli huonosti erilaistunut (Kuva. 3a, b, ylimmät paneelit). Kaikissa kohtalaisesti erilaistuneissa imusolmukemetastaattisissa leesioissa oli voimakas ydin β-kateniinivärjäytyminen sekä voimakas kalvovärjäytyminen E-kadheriinille ja puuttuva vimentiinivärjäytyminen (kuva 3a), mikä viittaa epiteeliominaisuuksien säilymiseen AKP270/fl-metastaattisissa soluissa, jotka säilyttivät kohtalaisesti erilaistuneet piirteet. Siinä yhdessä AKP270/fl-hiiressä, jonka imusolmukemetastaasissa oli heikosti erilaistuneita piirteitä, myös keuhkoissa, maksassa ja paksusuolessa havaittiin morfologialtaan heikosti erilaistuneita adenokarsinoomavaurioita (kuva 3b ja lisäkuva 1). Huonosti erilaistuneessa cecum-leesiossa ja metastaattisissa leesioissa esiintyi voimakasta nukleaarista β-kateniinivärjäytymistä ja E-kadheriini-ekspression häviämistä sekä voimakasta vimentiini-ekspressiota, mikä oli yhdenmukaista epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän (EMT) piirteiden kanssa (Kuva 3b ja Täydentävä kuva 1). Kaikki AKP270/fl-hiirten metastaattiset leesiot värjäytyivät positiivisesti CDX2:n suhteen (Täydentävä kuva 2), mikä on yhdenmukaista niiden paksusuolen epiteeliperäisyyden kanssa.

Paksusuolesta peräisin olevat metastaattiset kasvaimet, joissa on missense-trp53-mutaatioita, voivat läpikäydä epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän (EMT). Fotomikroskooppikuvat H&E-värjätyistä leikkeistä, joissa näkyvät kahdessa edustavassa AKP270/fl-hiiressä todetut imusolmuke- ja keuhkometastaasit (a, b, yläpaneelit). Immunohistokemialliset värjäykset, jotka osoittavat β-kateniinin voimakasta ydinvoimaista ilmentymistä, E-kadheriinin voimakasta kalvojen ilmentymistä ja vimentiinin ilmentymisen puuttumista yhdestä edustavasta hiirestä löydetyissä kohtalaisesti erilaistuneissa leesioissa (a, kolme alinta paneelia). Toisessa hiiressä (b) havaituissa heikosti erilaistuneissa leesioissa (b) on sen sijaan havaittavissa β-kateniinin voimakasta ydinvoimaista ilmentymistä, E-kadheriinin ilmentymisen häviämistä ja vimentiinin voimakasta ilmentymistä, mikä osoittaa, että tässä hiiressä havaitut metastaattiset leesiot ovat läpikäyneet EMT:n (b, kolme alinta paneelia). H&E-värjättyjen leikkeiden edustavat mikroskooppikuvat on esitetty orientoinnin vuoksi pienellä suurennoksella; sarjapoikkileikkeille tehtiin immunohistokemiallinen värjäys, ja laatikoidut alueet, joilla on β-kateniini-, E-kadheriini- ja vimentiinivärjäykset, on esitetty suurennoksella. Mittakaavapalkit: 20 μm kaikissa kuvissa

Kaksi kolmesta kasvainta kantavien AKPfl/fl-hiirten imusolmukemetastaasista oli kohtalaisesti erilaistuneita ja yksi huonosti erilaistunut (kuva 4a, b, yläpaneelit). AKPfl/fl-hiirellä, jolla oli maksametastaasi, oli kohtalaisen erilaistunut imusolmukemetastaasi. Tässä hiiressä, jolla oli maksametastaasi, paksusuolen oletetussa indeksiperäisessä adenokarsinoomassa sekä imusolmuke- ja maksametastaasileesioissa ilmeni kaikissa vahvasti β-kateniinin ydinvoimaista ilmentymistä ja vahvasti E-kadheriinin kalvovoimaista ilmentymistä (lisäkuva 3). Yksittäisessä AKPfl/fl-hiiressä, jolla oli huonosti erilaistunut imusolmukemetastaasi, todettiin myös useita morfologialtaan samanlaisia leesioita sen keuhkoissa (kuva 4b). Immunohistokemialliset tutkimukset osoittivat, että keuhkojen metastaattisissa leesioissa ja oletetussa indeksiperäisessä primaarisessa adenokarsinoomassa paksusuolessa oli kaikissa vahva β-kateniinin ydinvoimainen ilmentyminen ja vähentynyt E-kadheriinin ilmentyminen sekä voimakas vimentiinin ilmentyminen, mikä oli sopusoinnussa EMT:n kanssa primaarisyövässä ja metastaattisissa soluissa (kuva 4b). AKPfl/fl-hiirten metastaattiset leesiot olivat kaikki CDX2-positiivisia (täydentävä kuva 4). Kaiken kaikkiaan tietomme osoittavat, että AKP270/fl-hiirillä tai AKPfl/fl-hiirillä syntyneiden metastaattisten leesioiden histologisissa piirteissä ei ole merkittävää eroa, ja primaarikasvainten ja metastaattisten leesioiden huonosti erilaistunut osajoukko, jolla on missense- tai nollatransaktiomutaatioita Trp53:ssa, voi ilmentää EMT:n piirteitä.

Kolonista peräisin olevissa metastaattisissa kasvaimissa, joissa on nolla Trp53-mutaatioita, voi tapahtua epiteeli-mesenkymaalinen siirtymä (EMT). a Mikroskooppikuva H&E-värjätystä leikkeestä, jossa näkyy edustavan AKPfl/fl-hiiren imusolmukkeesta löytynyt kohtalaisesti erilaistunut kasvainleesio, joka on todettu 2,5 kuukautta TAM-ruiskeen antamisen jälkeen (ylempi osa). Tämän leesion immunohistokemialliset värjäykset osoittavat β-kateniinin voimakasta ydinvoimaista ilmentymistä, E-kadheriinin voimakasta kalvojen ilmentymistä ja vimentiinin ilmentymisen puuttumista (kolme alempaa paneelia). b H&E-värjätyistä leikkeistä otetut mikroskooppikuvat, joissa näkyvät toisen AKPfl/fl-hiiren 4 kuukautta TAM-injektion jälkeen paksusuolessa, imusolmukkeessa ja keuhkoissa todetut heikosti erilaistuneet leesiot (yläpaneeli). Kaikissa näissä leesioissa on vahva β-kateniinin ydinvoimainen ilmentyminen, E-kadheriinin ilmentymisen häviäminen ja vahva vimentiinin ilmentyminen, mikä osoittaa, että tässä hiiressä havaitut primaariset ja metastaattiset leesiot ovat läpikäyneet EMT:n (kolme alinta paneelia). H&E-värjättyjen leikkeiden edustavat mikroskooppikuvat on esitetty orientoinnin vuoksi pienellä suurennoksella; sarjapoikkileikkeille tehtiin immunohistokemiallinen värjäys, ja laatikoidut alueet, joissa on β-kateniinin, E-kadheriinin ja vimentiinin värjäytymiä, on esitetty suurennoksella. Mittakaavapalkit: 20 μm kaikissa kuvissa

Misssense-mutantti p53-proteiinin stabiloituminen liittyy villityyppisen p53:n häviämiseen ja taudin etenemiseen

Vähemmistössä ihmiskasvaimista, joissa on missense TP53 -mutaatioita, on raportoitu esiintyvän TP53:n häviämistä heterotsygoottisuudesta (LOH) , ja eräässä tutkimuksessa osoitettiin, että TP53:n häviäminen heterotsygoottisuudesta (LOH) on sekä hiiren sarkoomissa että rintakarsinoomissa edellytys missense-mutantti p53:n stabiloitumiseen . Arvioimme p53-värjäytymismalleja AKP270/+-hiirten kasvainkehityksen eri vaiheissa sen jälkeen, kun kasvainten synty oli indusoitu TAM-injektiolla, koska AKP270/+-hiirten Cre-kohdennetussa paksusuolen epiteelissä on alun perin yksi toimiva Trp53-alleeli. AKP270/+-hiirten hyperplastisissa polyypeissä, joissa Kras on aktivoitunut eikä Apc LOH:ta ollut vielä tapahtunut, p53-värjäytyminen ei ole havaittavissa (kuva 5b, paneeli HP), kuten p53:n negatiivinen värjäytyminen villiintyneiden hiirten epiteelissä (kuva 5a), vaikka p53 R270H missense -mutaatioproteiini ekspressoituu AKP270/+-hiirten paksusuolen kudoksissa. Jonkin verran p53-immunoreaktiivisuutta näkyi selvästi AKP270/+-hiirissä syntyneissä adenoomissa (kuva 5b, paneeli adenooma ja taulukko 3, n = 185) ja karsinoomissa (kuva 5c ja taulukko 3, n = 28). Näistä kasvaimista 94 %:ssa adenoomista ja 43 %:ssa karsinoomista oli heikko p53-värjäytyminen (kuva 5 ja taulukko 3, 5-10 %:n positiivisuus), kun taas 6 %:ssa adenoomista ja 57 %:ssa karsinoomista oli vahva p53-värjäytyminen (kuva 5 ja taulukko 3, >10 %:n positiivisuus, P < 0,0001). Suurimmassa osassa kasvaimista, joissa oli voimakas p53-värjäytyminen, todettiin p53:n LOH, kun taas kasvaimissa, joissa oli heikko p53-värjäytyminen, säilyi edelleen Trp53:n villityyppinen alleeli (kuva 6). Tuloksemme ovat samankaltaisia kuin hiljattain tehdyissä töissä, jotka koskevat p53-missense-proteiinin ilmentymistä hiiren sarkoomissa ja rintasyövässä . Tietomme osoittavat, että kuten ihmisen paksusuolen kasvainten synnyssä , stabiloidun missense-mutaatioproteiinin p53:n ilmentyminen korreloi läheisesti villin tyypin p53:n toiminnan menettämisen ja invasiiviseksi etenemisen kanssa.

P53R270H-mutanttiproteiinin stabiloituminen kasvaimen etenemisen aikana hyperplasiasta karsinoomaan AKP270/+-hiirillä. P53:n immunohistokemiallinen värjäytyminen edustavassa hyperplastisessa polyypissä (HP, b, vasen paneeli), adenoomassa (b, oikea paneeli) ja kolmessa karsinoomassa (c), jotka ovat syntyneet AKP270/+-hiirten cecumissa. Kontrollina käytettiin villityyppisen hiiren paksusuolen leikettä (a). P53-värjäytyminen vaihtelee havaitsemattomasta värjäytymisestä normaaleissa (a) ja HP (b) -leikkeissä, heikkoon värjäytymiseen (<10 % positiivisuus) adenoomassa (b) ja karsinoomassa 1 (c, vasen paneeli) ja vahvaan värjäytymiseen karsinoomissa 2 ja 3 (>10 % positiivisuus). Katkoviivat osoittavat muscularis mucosae. Mustat nuolet osoittavat invasiivisia rauhasia, joissa on heikko p53-värjäytyminen; punaiset nuolet osoittavat invasiivisia rauhasia, joissa on vahva p53-värjäytyminen. Mittakaavapalkit: 50 μm

P53R270H missense -mutaation stabiloituminen korreloi p53-heterotsygoottihäviön (LOH) kanssa. a Paksusuolen kasvainten (T2-T6) genotyypin määritys, jotka syntyivät AKP270/+-hiirillä 5 kuukautta TAM-induktion jälkeen. Positiivisena ja negatiivisena kontrollina käytetään AKP270/fl-hiiressä syntynyttä kasvainta (T1) ja villityypin hiiren paksusuolen kudosta (N). Trp53:n villityyppisen alleelin ja rekombinoidun Trp53-mutanttialleelin (flox out) esiintyminen havaittiin PCR:llä. b-e P53:n immunohistokemiallinen värjäys paksusuolen kudoksissa, jotka on kuvattu kohdassa (a), osoittaa vahvan korrelaation mutantti p53:n stabiloitumisen (d, T2 ja T3) ja p53:n heterotsygoottiuden häviämisen välillä verrattuna heikkoon p53:n värjäytymiseen ja villiintyneen Trp53:n villityyppisen alleelin läsnäoloon kasvaimissa 4 6 – 6 (e). Katkoviivat osoittavat muscularis mucosae. Mittakaavapalkit: 100 μm

Geeniekspressioprofilointi paljastaa vain vähän eroja R270H/R273H missense-mutantti- ja nolla Trp53/TP53-alleeleja sisältävien hiiren tai ihmisen paksusuolen kasvainten välillä

Profiloimme geeniekspressiota paksusuolen adenokarsinoomakudoksessa, joka saatiin AKP270/fl-hiiriltä (n = 6) tai AKPfl/fl-hiiriltä (n = 6), Affymetrix Mouse ST 2 -hiiren avulla.1 Arrays, jossa on 24 562 anturisarjaa. Eristimme RNA:ta syöpäsolujen laserkeilausmikrodissektion (LCM) jälkeen yhdestä invasiivisesta primaarikasvaimesta kustakin hiirestä. Kontrolleina käytettiin villityyppisten hiirten (n = 3) mikrodissekoituja normaaleja paksusuolen epiteelisoluja. Sovitimme näille 15 näytteelle ANOVA-mallit, joissa oli 3 keskiarvon termit. Kasvainkudosten vertailu normaaleihin kudoksiin antoi yli 2400 koesarjaa, joiden P < 0,001 oli sekä AKP270/fl- että AKPfl/fl-kasvainten osalta, mutta näiden kahden kasvaintyypin vertailu toisiinsa antoi vain 30 koesarjaa, kun pelkän sattuman perusteella odotimme 24,6 koesarjaa (24 562*0,001). Tämä jälkimmäinen tulos osoittaa, että suurin osa löydetyistä 30 koettimen joukosta on vääriä positiivisia tuloksia (taulukko 4, yläosa), ja geeniekspressiossa oli vain vähän, jos lainkaan, merkittäviä havaittavia eroja paksusuolen kasvainten välillä, joissa oli Trp53 missense -mutaatioita, ja niiden välillä, joissa oli Trp53 null -mutaatioita. Tämän käsityksen mukaisesti havaitsimme, että AKP270/fl- ja AKPfl/fl-adenokarsinoomat eivät eronneet toisistaan geeniekspression pääkomponenttianalyyseissä (PC), vaikka molemmilla kasvainryhmillä on geeniekspressiomalleja, jotka eroavat selvästi villityyppisestä paksusuolen epiteelistä (Täydentävä kuva. 5).

Toimme Affymetrix-geeniekspressioanalyysejä myös organoideista, jotka oli johdettu paksusuolen kasvaimista, jotka olivat syntyneet AKP270/fl-hiirissä (n = 3) tai AKPfl/fl-hiirissä (n = 2). Kontrolleina käytettiin Apcfl/fl-hiirten adenoomista (Cont 1, n = 3) tai villityypin paksusuolen epiteelistä (Cont 2, n = 4) peräisin olevia organoideja. Sovelsimme ANOVA-mallin neljälle organoidiryhmälle. Löysimme 435 anturisarjaa, joiden P < 0,001, AKPfl/fl-organoideista ja 609 anturisarjaa AKP270/fl-organoideista verrattuna Apc-null-organoideihin (Cont 1, taulukko 4). Lisäksi tunnistettiin enemmän eri tavoin ilmentyneitä koettimien sarjoja (960 AKPfl/fl:lle ja 1332 AKP270/fl:lle, P < 0,001), kun AKPfl/fl- tai AKP270/fl-organoideja verrattiin normaaleihin paksusuolen organoideihin (Cont 2, taulukko 4). Teimme polkujen rikastumistestin geeneille, jotka ilmentyivät eri tavoin sekä AKPfl/fl- että AKP270/fl-kasvaimissa ja organoideissa verrattuna normaaliin paksusuolen epiteeliin. Havaitsimme, että useat polut olivat merkittävästi muuttuneet sekä p53-nolla- että missense-mutantti-tuumorista peräisin olevissa soluissa, ja merkittävimmin muuttuneet geenijoukot olivat geenit, jotka osallistuvat G2M-valvontapisteeseen, solun kasvuun, stressivasteeseen ja solun aineenvaihduntaan (lisätaulukko 2). Saimme kuitenkin vain 35 koetinjoukkoa, joiden P < 0,001 oli P < 0,001 AKPfl/fl vs. AKP270/fl -vertailussa (taulukko 4), jossa taas 24,6 oli odotettavissa sattuman perusteella, mikä osoittaa, että oli vaikea löytää geeniekspressioeroja nolla- ja missense Trp53-mutaatioita sisältävien organoidien välillä. PC-plotit osoittivat, että AKPfl/fl- ja AKP270/fl-näytteet klusteroituivat aina yhteen, ja ne erotettiin Apc-mutanttiadenoomista (Cont1, lisäkuva 6) tai normaalista paksusuolen epiteelistä (Cont2, lisäkuva 6) peräisin olevista organoideista.

Testataksemme, oliko ihmisen CRC:n, joissa oli missense- ja null TP53-mutaatioita, geeniekspressiomalleissa osoitettavissa olevia eroja, analysoimme The Cancer Genome Atlas (TCGA) -tietokannassa olevien CRC:iden RNA-seq-tiedoista saadut log2-muunnetut normalisoidut lukumäärät, verrattiin 9:ää kasvainta, joissa oli TP53:n koodonin 273 missense-mutaatioita, 36:een kasvaimeen, joissa oli nollamutaatioita (jotka johtuivat frame shift-, splice site- ja nonsense-mutaatioista, ks. lisätietoja lisätaulukosta 3) kahden otoksen T-testillä 20531 geenin osalta. Löysimme vain 244 geeniä, joiden P < 0,01, ja 30 geeniä, joiden P < 0,001, mikä oli vain hieman enemmän kuin sattuman perusteella odotettu määrä (205 ja 20,5, taulukko 4). TP53 itsessään antoi merkittävimmän eron geeniekspressiossa, sillä se oli keskimäärin lähes viisinkertainen kasvaimissa, joissa oli nollamutaatioita, verrattuna TP53:n koodonin 273 mutaatioihin (lisätaulukko 4, P = 2 × 10-10). Tässäkin PC-analyysissä havaittiin, että nämä kaksi kasvainryhmää eivät juurikaan eronneet toisistaan (täydentävä kuva 7). Samanlaisen transkriptiosignatuurin mukaisesti sovelsimme Coxin suhteellisten vaarojen mallit 43 potilaalle, joilla oli elossaolotietoja, käyttäen mallissa ikää, vaihetta ja TP53-statusta, emmekä havainneet merkittävää yhteyttä potilaan lopputuloksen ja TP53-mutaatiostatuksen välillä (R273 missense -mutaatio vs. nollamutaatio, lisätaulukko 5, P = 0,67 Waldin testillä). On syytä mainita, että koska näiden potilaiden joukossa oli vain 7 kuolemantapausta, teho erojen havaitsemiseen oli melko pieni. Lopuksi tarkastelimme niiden geenien leikkauspistettä, jotka antoivat P < 0,05 missä tahansa edellä kuvatuista kolmesta aineistosta (eli ihmisen ja hiiren paksusuolen kasvaimet, hiiren paksusuolen organoidit), jotka muuttuivat samaan suuntaan Trp53/TP53 missense vs. null -vertailussa. Täydentävässä taulukossa 4 näytetään geenit, jotka antoivat P < 0,05 ja vähintään 1,3-kertaisen muutoksen missä tahansa kahdessa kolmesta datasarjasta. Löysimme vain Trp53/TP53:n, joka muuttui samaan suuntaan kaikissa kolmessa tutkimuksessa (Täydentävä taulukko 4; kunkin geenin yksityiskohtaiset tilastot kaikissa kolmessa tietokokonaisuudessa ovat saatavilla julkisessa GEO-sarjassamme). Kaiken kaikkiaan hiiren ja ihmisen CRC:n geeniekspressioanalyysimme osoittavat, että paksusuolen kasvaimilla, joissa on R270/R273 missense- tai nolla Trp53/TP53-mutaatioita, on hyvin samankaltaiset geeniekspressioprofiilit, mikä on sopusoinnussa sen kanssa, että paksusuolen kasvaimissa ei ole merkittäviä eroja biologisissa ominaisuuksissa ja fenotyypeissä, jotka syntyvät vivo-tilanteessa AKP270/fl- ja AKPfl/fl-hiirillä.