Trametes spp. uutteiden antigenotoksinen vaikutus ihmisen perifeeristen valkosolujen DNA-vaurioita vastaan

Abstract

Trametes-lajeja on käytetty tuhansia vuosia perinteisessä ja perinteisessä lääketieteessä erilaisten sairauksien hoitoon. Tavoitteena oli arvioida valittujen Trametes-lajien myseeli- ja basidiokarppiuutteiden mahdollisia antigeenitoksisia vaikutuksia ja arvioida riippuvuutta niiden antioksidatiivisesta potentiaalista. Tutkitut lajit olivat Trametes versicolor, T. hirsuta ja T. gibbosa. Lajien basidiokarppiuutteilla ja myseeliuutteilla arvioitiin uutteiden antigenotoksisia vaikutuksia ihmisen perifeerisiin valkosoluihin. Alkaalista komeettatestiä käytettiin DNA-säikeiden katkeamisten ja alkalileimautumiskohtien havaitsemiseen sekä DNA:n migraation laajuuden määrittämiseen. DPPH-testiä käytettiin uutteiden antioksidatiivisten ominaisuuksien arviointiin. T. versicolor- ja T. gibbosa -lajien sekä T. hirsuta -lajien hedelmärunkouutteet, lukuun ottamatta 20,0 mg/ml:n uutetta, eivät olleet genotoksisia aineita. T. versicolor -uutteella oli 5,0 mg/ml:ssa suurin antigenotoksinen vaikutus sekä leukosyyttien esi- että jälkikäsittelyssä. Kolmen lajin myseeliuutteilla ei ollut genotoksista vaikutusta ja niillä oli merkittävä antigenotoksinen vaikutus H2O2:n aiheuttamia DNA-vaurioita vastaan sekä esi- että jälkikäsittelyssä. Tulokset viittaavat siihen, että näiden kolmen lajin uutteita voidaan pitää vahvoina antigenotoksisina aineina, jotka kykenevät stimuloimaan solujen genosuojan vastetta.

1. Johdanto

Sieniä on pitkään käytetty elintarvikkeena, mutta yhtä lailla perinteisessä lääketieteessä sekä läntisessä että itäisessä maailmassa . Vaikka lukuisat sienet on tunnustettu terveellisiksi elintarvikkeiksi , niiden suuri farmakologinen potentiaali on edelleen alihyödynnetty . Maailmassa tiedetään elävän lähes 60 Trametes-lajia , mutta vain muutama niistä on tutkittu lääkinnällisten ominaisuuksiensa vuoksi. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd on suvun tunnetuin lääkelaji. Tätä lajia, jonka kansanomaisia nimiä ovat Turkey Tail länsimaisissa kulttuureissa, Yun-Zhi (pilvimäinen sieni) Kiinassa tai Kawaratake (sieni joen rannalla) Japanissa, on käytetty tuhansia vuosia perinteisessä lääketieteessä erityisesti Aasiassa . Ming-dynastian aikana kirjoitetun Compendium of Chinese Materia Medica -teoksen mukaan T. versicolorista on kirjattu yli 120 kantaa, ja perinteisessä kiinalaisessa lääketiede-käytännössä tätä sientä pidetään hyödyllisenä myrkkyjen poistamisessa, vahvistamisessa, energian lisäämisessä, maksan ja pernan toiminnan parantamisessa ja immuunivasteen tehostamisessa, erityisesti kun se kuivataan, jauhetaan ja valmistetaan teeksi . Kaikkia näitä ominaisuuksia pidettiin kansanlääketieteessä erittäin hyödyllisinä Trametes spp. valmisteiden kroonisessa käytössä. Perinteisessä lääketieteessä lajia käytetään pääasiassa erityyppisten syöpien hoitoon, mutta myös krooniseen hepatiittiin, nivelreumaan ja hengitysteiden, virtsateiden ja ruoansulatuskanavien infektioihin, mikä on vahvistettu lukuisissa tutkimuksissa . Lisäksi on raportoitu joidenkin T. versicolorista eristettyjen polysakkaropeptidien voimakkaista antiviraalisista vaikutuksista ja Trametes spp:n hedelmärunkouutteiden merkittävästä antioksidatiivisesta aktiivisuudesta . Nämä vaikutukset perustuvat pääasiassa polysakkaridi krestiinin (PSK) ja erilaisten polysakkaridi-peptidikompleksien tuotantoon, yhdisteisiin, jotka vähentävät syövän etäpesäkkeitä ja stimuloivat interleukiini-1:n tuotantoa ihmissoluissa .

Vapaiden radikaalien runsas esiintyminen ympäristössä liittyy oksidatiivisen stressin esiintymiseen, joka on ikääntymisen ja erilaisten sairauksien ja häiriöiden, joista suuri osa maailman väestöstä kärsii ja joihin suuri osa kuolee, alkamisen ja etenemisen perusta . DNA on herkempi hapettumisvaurioille kuin muut makromolekyylit. DNA-vaurioita, kuten säikeiden katkeamisia, voivat aiheuttaa erilaiset aineet, joista H2O2:lla on genotoksinen vaikutus. Tiedetään, että nämä vauriot voivat vaikuttaa immuunivasteeseen paitsi tulehdussairauksissa myös syövissä . Komeettatesti on vakiintunut ja tehokas, erittäin herkkä testi, jota on käytetty DNA-vaurioiden tutkimiseen, ja sitä voidaan soveltaa useiden luontaistuotteiden genotoksisen ja suojaavan potentiaalin arvioimiseen .

DNA:n oksidatiivisten vaurioiden vähentämiseen perustuvalla sieniuutteiden genosuojatoiminnalla voi myös olla merkittävä rooli useiden mainittujen sairauksien ja häiriöiden ehkäisyssä ja hoidossa, mutta hyvin harvoissa tutkimuksissa on tähän asti pidetty sitä mahdollisena keinona erilaisissa terapioissa . Tämän vuoksi tutkimuksen tavoitteena oli arvioida valittujen Trametes-lajien myseeli- ja basidiokarppiuutteiden antigenotoksisia vaikutuksia ihmisen perifeerisiin valkosoluihin ja arvioida riippuvuutta niiden antioksidatiivisesta potentiaalista.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät

. Organismit ja viljelyolosuhteet

Trametes versicolor BEOFB 321:n, T. hirsuta BEOFB 301:n ja T. gibbosa BEOFB 310:n viljelmät eristettiin Serbiasta kerätyistä hedelmöittyneistä rungoista, ja niitä ylläpidettiin mallasagar-alustalla Belgradin yliopiston biologisen tiedekunnan kasvitieteen laitoksen (BEOFB) viljelmäkokoelmissa.

Ilmoitusmateriaali valmistettiin inokuloimalla siihen 100,0 ml synteettistä elatusalustaa (glukoosia, 10 %.0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; hiivauute, 2,0 g L-1; pH 6,5), jossa oli 25 sienilevyä (Ø 0.5 cm, 7 päivää vanhasta mallasagariviljelmästä) 250 ml:n pulloissa ja inkubointi pyörivällä ravistimella 100 rpm huoneenlämmössä (°C) 7 d. Näin saatu biomassa pestiin ja homogenisoitiin 100,0 ml:lla steriiliä tislattua vettä (dH2O) laboratoriosekoittimessa. Homogenisoitua biomassaa (30,0 ml) käytettiin 500,0 ml:n modifioidun synteettisen väliaineen (jossa oli glukoosia 65,0 g L-1) inokulaatioon. Uppoviljely suoritettiin 1000 ml:n pulloissa huoneenlämmössä pyörivällä ravistimella 21 d. Saatu biomassa suodatettiin, pestiin 3 kertaa dH2O:lla magneettisekoittimella ja kuivattiin 50 °C:ssa vakiopainoon.

2.2. Sieniuutteiden valmistaminen

Kuivattu hedelmäntuotanto ja myseeli (3,0 g) uutettiin sekoittamalla 90,0 ml:lla 96-prosenttista etanolia 30 °C:ssa 72 tunnin ajan. Tuloksena saadut uutteet sentrifugoitiin (20 °C, 3000 rpm, 15 min) ja supernatantit suodatettiin Whatmanin numero 4 -suodatinpaperin läpi, konsentroitiin alennetussa paineessa kiertohaihduttimessa (BÜCHI R-114, Sveitsi) 40 °C:ssa kuivaksi ja liuotettiin uudelleen 96-prosenttiseen etanoliin antioksidanttimääritystä varten tai veteen antigeenitoksisuusmääritystä varten alkupitoisuuteen 20,0 mg ml-1. Uuttotuotos ilmaistiin prosentteina kuivapainon perusteella.

2.3. Geenisuojaava aktiivisuus

2.3.1. Koehenkilöt

Heparinoidut kokoverinäytteet saatiin laskimopistolla kolmelta terveeltä, alle 25-vuotiaalta luovuttajalta. Tutkimukseen osallistujat olivat tupakoimattomia ja alkoholittomia, jotka eivät saaneet mitään hoitoa tai lääkkeitä eivätkä käyttäneet ravintolisiä.

2.3.2. Tutkimuksen tulokset. Tutkimusasetelma

Kaikkien uutteiden ja pitoisuuksien (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 ja 0,312 mg ml-1) geenitoksisuutta tutkittiin käsittelemällä ihmisen perifeerisiä valkosoluja 37 °C:ssa 30 minuutin ajan DNA-vaurioiden arvioimiseksi. Tavallisesti käytetään valkosoluja, koska ne saadaan suhteellisen noninvasiivisella tavalla, ne eivät vaadi kudoksen pilkkomista ja ne käyttäytyvät hyvin komeettamäärityksessä. Käsittelyä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) 37 °C:ssa 30 minuutin ajan käytettiin positiivisena kontrollina ja käsittelyä 25,0 μM H2O2:lla jäällä 15 minuutin ajan negatiivisena kontrollina.

Kahta toisistaan riippumatonta protokollaa käytettiin uutteiden antigeenitoksisen potentiaalin arvioimiseksi käyttämällä esikäsittelyä ja jälkikäsittelyä uutteilla. Esikäsittelyssä soluja inkuboitiin uutteiden kanssa 37 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ne pestiin PBS:llä ja altistettiin H2O2:lle 15 minuutin ajan. Jälkikäsittelyssä soluja käsiteltiin H2O2:lla jäällä 15 minuutin ajan, huuhdeltiin PBS:llä ja sen jälkeen soluja käsiteltiin seitsemällä uutepitoisuudella 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Kunkin käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS:llä. Inkubointi PBS:llä 37 °C:ssa 30 minuutin ajan oli negatiivinen kontrolli ja käsittely 25,0 μM H2O2:lla jäällä 15 minuutin ajan oli positiivinen kontrolli.

Kullekin kokeelle tehtiin kolme toistoa ja kustakin analysoitiin 100 ydintä.

2.3.3. Yksittäisen solun geelielektroforeesimääritys

Komet-määritys suoritettiin Singhin ym. kuvaamalla tavalla. Emäksisellä komeettatestillä pystytään havaitsemaan DNA-säikeiden katkeamiset ja alkalilabiilit kohdat, ja DNA:n migraation laajuus osoittaa DNA-vaurion asteen soluissa.

Kokonaisverinäytteet (6,0 μl) suspendoitiin 0,67-prosenttiseen matalan sulamispisteen (low-melting-point, LMP) agaroosiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja pipetoitiin supersulatetulle lasiselle mikroskooppilasille, jotka oli esipäällystetty 1 %:n normaalin sulamispisteen agaroosikerroksella (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), levitettiin peitelevyn avulla ja pidettiin jäässä 5 minuuttia jähmettymässä. Kun peitinliuskat oli varovasti poistettu, objektilasien solususpensiot käsiteltiin uutteilla ja H2O2:lla edellä kuvatulla tavalla. Käsittelyjen jälkeen kaikki objektilasit peitettiin kolmannella kerroksella 0,5-prosenttista LMP-agaroosia, jonka annettiin jälleen jähmettyä jäällä 5 minuutin ajan. Peitelevyjen poistamisen jälkeen objektilasit asetettiin kylmään lysointiliuokseen (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1 % Triton X100 ja 10 % dimetyylisulfoksidi, pH 10,0, joka on säädetty NaOH:lla) 4 °C:n lämpötilaan yön yli, minkä jälkeen ne elektroforeesattiin ja värjättiin etidiumbromidilla. Komeetat havainnoitiin ja analysoitiin Olympus ×50 -mikroskoopilla (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Saksa), joka oli varustettu fluoresenssin tallennuslaitteella 100-kertaisella suurennoksella. DNA-vaurioiden arviointi suoritettiin Andersonin ym. kuvaamalla tavalla. Solut nimittäin luokiteltiin silmämääräisesti viiteen luokkaan, jotka vastasivat seuraavia DNA:n määriä pyrstössä: (A) ei vaurioita, <5 %; (B) vähäinen vaurio, 5-20 %; (C) keskisuuri vaurio, 20-40 %; (D) suuri vaurio, 40-95 %; (E) kokonaisvaurio, >95 % (kuva 1). Analyysi tehtiin 100 satunnaisesti valitulle solulle koehenkilöä kohti (50 solua kummastakin kahdesta toistetusta objektilasista). Tietojen semikvantitatiivisen analyysin saamiseksi DNA-vaurio luonnehdittiin DNA-migraatioksi, joka oli yli 5 % (B + C + D + E comet-luokat).

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)

Kuva 1

DNA-vaurioiden luokittelu DNA:n hännän määrän mukaan.

2.4. Antioksidanttinen aktiivisuus

2.4.1. DPPH- määritys

Antioksidanttinen aktiivisuus määriteltiin mittaamalla stabiilin 1,1-difenyyli-2-pikryylihydrazyyliradikaalin violetin värisen metanoliliuoksen valkaisu () . Pelastava vaikutus mitattiin spektrofotometrisesti (CECIL CE 2501) 517 nm:ssä ja laskettiin yhtälön avulla: missä on negatiivisen kontrollin absorbanssi (reaktioseos ilman uutetta) ja on reaktioseoksen absorbanssi.

Urteen konsentraatio (mg uutetta/ml), joka tuottaa 50 %:n pelkistymisen (EC50), saatiin lineaarisen regressioanalyysin interpoloimalla. Kaikki mittaukset tehtiin kolmena kappaleena tilastollista analyysia varten. Positiivisena kontrollina käytettiin kaupallista antioksidanttia, butyylihydroksianisolia (BHA), jonka pitoisuus vaihteli välillä 20,0 mg ml-1-0,02 mg ml-1.

2.4.2. Kokonaisfenolipitoisuuden määrittäminen

Kokonaisfenoliyhdisteiden pitoisuus sieni-uutteissa arvioitiin Folin-Ciocalteu-reagenssilla Singletonin ja Rossin menetelmän mukaisesti käyttäen galliinihappoa standardina. Pitoisuus määritettiin μg:na gallushappoekvivalentteja (GAE) mg:aa kuivauutetta kohti käyttäen yhtälöä, joka saatiin standardigallushappokäyrästä

2.4.3. Kokonaisflavonoidipitoisuuden määrittäminen

Kokonaisflavonoidipitoisuus määritettiin Park et al. menetelmillä käyttäen kversetiiniä standardina. Määrä ilmaistiin μg:na kversetiiniekvivalentteja (QE) mg:aa kuivauutetta kohti käyttäen kversetiinihydraattistandardin kuvaajasta saatua yhtälöä

2.5. Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistiin kolmesta rinnakkaisesta mittauksesta saatujen tietojen keskiarvona ± keskivirhe. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) suoritettiin STATISTIKA-ohjelmiston versiolla 5.0 (StatSoft Inc.) merkittävien erojen testaamiseksi. alle 0,01 arvoja pidettiin tilastollisesti merkitsevinä. Comet-määrityksestä saatujen tietojen tilastollinen analyysi suoritettiin χ2-testillä käyttäen Statgraph 4.2 -ohjelmistoa. χ2-testin suorittamiseksi kolmen kokeen tulokset yhdistettiin ja arvioimme DNA-vaurioita saaneiden solujen kokonaismäärän. Eroa klo pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Tulokset ja keskustelu

3.1. Tulokset ja keskustelu. Uuttotuotos

Myceliumbiomassan uuttotuotos oli kaikilla kolmella lajilla merkittävästi korkeampi verrattuna hedelmäelimeen (). T. gibbosa -lajin uuttotuotos kuivatusta mykeliumbiomassasta oli korkein (34,6 %) ja kuivattujen hedelmärunkojen uuttotuotos oli alhaisin (2,2 %). Korkein hedelmäkappaleen uuttotulos, 6,67 %, havaittiin T. versicolorilla, jonka myseelin uuttotulos oli 8,0 %. T. hirsuta -lajin saannot olivat 12,0 % (myseeli) ja 2,85 % (hedelmärunko). Lajien väliset erot uuttotehokkuudessa olivat tilastollisesti merkitseviä sekä mykeliumin että hedelmärungon osalta ().

Varhaisemmat raportit osoittivat biomassan uuttokyvyn riippuvan lajista, kannasta ja liuottimesta . Niinpä Ren et al. havaitsivat, että T. gibbosa basidiocarpin uuttotulokset olivat 1,22 % petrolieetteriuutteella, 6,44 % etyyliasetaatilla ja 9,2 % metanoliuutteella. Metanoli oli myös hyvä liuotin T. versicolor basidiocarpille, jonka saanto vaihteli 4,1 prosentista 9,16 prosenttiin. Tulostemme perusteella voidaan päätellä, että alkoholit ovat parhaita liuottimia, mutta etanoli on heikompi kuin metanoli.

3.2. Geenisuojaava aktiivisuus

Koska kaikki verenluovuttajat olivat hyväkuntoisia ja samanikäisiä eikä heillä ollut lääkitystä, tilastollinen analyysi ei osoittanut selkeitä eroja heidän vasteissaan uutteisiin. Siksi kolmen kokeen tulokset yhdistettiin. Perifeerisen veren leukosyyttien käsittely H2O2:lla aiheutti nopean ja voimakkaan yksisäikeisten katkosten indusoitumisen ydin-DNA:ssa, mikä näkyi komeettatestissä DNA:n migraationa.

Tuloksemme osoittivat, että T. versicolor -hedelmäkasviuutteet 0,312 – 20.0 mg ml-1 ei aiheuttanut merkittävää kasvua DNA-vaurioituneiden solujen kokonaismäärässä positiiviseen kontrolliin verrattuna, mikä osoittaa selvästi, että testattu uute ei ollut genotoksinen aine (kuva 2(a) (A)). DNA:n kokonaisvaurioiden jakauma (arvo) oli myös sama kuin positiivisessa kontrollissa. Toisaalta nämä uutteet osoittivat suojaavia vaikutuksia H2O2:ta vastaan sekä leukosyyttien esi- että jälkikäsittelyssä (kuva 2(a) (B, C)). Otteella 5,0 mg ml-1 oli suurin vaikutus ja otteella 20,0 mg ml-1 pienin vaikutus molemmissa käsittelyissä. DNA:n kokonaisvaurion arvo pieneni tilastollisesti positiiviseen kontrolliin verrattuna kaikissa pitoisuuksissa ().

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Kuva 2

Trametes versicolor -lajin hedelmäesineuutteiden vaikutus (a), (b) T. hirsuta ja (c) T. gibbosa: (A) genotoksinen, (B) antigenotoksinen, esikäsittely ja (C) antigenotoksinen, jälkikäsittely. Tehtiin kolme riippumatonta koetta, joissa oli kolme toistoa per koe, ja ne arvioitiin comet-määrityksellä. Kutakin toistoa kohden analysoitiin 100 ydintä. Tiedot edustavat DNA-vaurion saaneiden solujen kokonaismäärää.

T. hirsuta -hedelmärunkouute ei kaikissa pitoisuuksissa paitsi 20,0 mg ml-1 osoittanut genotoksista aktiivisuutta, sillä DNA:n kokonaisvaurioiden määrä ei ollut tilastollisesti korkeampi kuin positiivisessa kontrollissa (kuva 2(b) (A)). Kuitenkin pitoisuudella 20,0 mg ml-1 genotoksinen vaikutus ja DNA:n kokonaisvaurio soluissa olivat tilastollisesti erilaisia kuin positiivisessa kontrollissa. Leukosyyttien esi- ja jälkikäsittelyissä uutteella oli kaikissa pitoisuuksissa korkeinta pitoisuutta lukuun ottamatta suojaava vaikutus H2O2:n aiheuttamilta DNA-vaurioilta, ja DNA:n kokonaisvaurio väheni merkittävästi positiiviseen kontrolliin verrattuna (Kuva 2(b) (B, C)). Näillä käsittelyillä oli annosriippuvainen korrelaatio, ja suurin suojavaikutus oli uutteen pitoisuudella 0,312 mg ml-1, kun taas pitoisuus 20 mg ml-1 ei osoittanut suojaa H2O2:n indusoimia komeettoja vastaan.

T. gibbosa -hedelmärunkouutteella ei havaittu myöskään genotoksista eikä merkittävää antigeenitoksista vaikutusta eli H2O2:n indusoimien DNA-vaurioiden vähenemistä sekä esi- että jälkikäsittelyn yhteydessä seitsemällä eri pitoisuudella käytettynä (kuva 2(c)). Toisin kuin T. hirsuta -uutteissa, T. gibbosa basidiocarp -uutteissa ei kuitenkaan havaittu annosriippuvaista vastetta; nimittäin uutepitoisuuden asteittainen pieneneminen ei vastannut H2O2:n aiheuttaman genotoksisuuden suhteellista vähenemistä.

T. versicolorin, T. hirsutan ja T. gibbosan mykiöuutteilla ei ollut genotoksista aktiivisuutta kaikissa analysoiduissa pitoisuuksissa (kuvat 3(a) (A), 3(b) (A) ja 3(c) (A)). Kaikilla myseeliuutteilla ja pitoisuuksilla oli merkittävä antigenotoksinen vaikutus H2O2:n aiheuttamia DNA-vaurioita vastaan sekä esi- että jälkikäsittelyssä, eivätkä nämä aktiivisuudet eronneet toisistaan merkittävästi. T. versicolorissa havaittiin hieman alhaisempi aktiivisuus pienimmällä uutepitoisuudella. T. hirsuta -lajissa pitoisuudet 5,0, 2,5 ja 20,0 mg ml-1 olivat tehokkaampia, kun taas T. gibbosa -lajissa suurin suojaava vaikutus havaittiin pitoisuudella 2,5 mg ml-1 ja pienin pitoisuudella 20,0 mg ml-1 (kuvat 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) ja 3(c) (B, C)).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Kuva 3

Trametes versicolor -lajin myseeliuutteiden vaikutus (a), (b) T. hirsuta ja (c) T. gibbosa: (A) genotoksinen, (B) antigenotoksinen, esikäsittely ja (C) antigenotoksinen, jälkikäsittely. Tehtiin kolme riippumatonta koetta, joissa oli kolme toistoa per koe, ja ne arvioitiin comet-määrityksellä. Kutakin toistoa kohden analysoitiin 100 ydintä. Tiedot edustavat DNA-vaurion saaneiden solujen kokonaismäärää.

Lukuisia mutageenisia ja karsinogeenisia yhdisteitä esiintyy eri luonnonlähteissä . Toisaalta jotkin luonnon yhdisteet voivat olla joko prooksidantteja, jotka aiheuttavat genotoksisia ja/tai sytotoksisia vaikutuksia, tai antioksidantteja, riippuen pitoisuudesta ja altistuksen kestosta . Ravitsemuksellisesti ja lääkinnällisesti arvokkailla sienilajeilla voi olla erilaisia in vitro- ja in vivo -vaikutuksia, jotka johtuvat joko niiden epävakaudesta ruoansulatusolosuhteissa tai imeytymiskyvyttömyydestä ruoansulatuskanavassa . In vitro saadut vaikutukset eivät nimittäin välttämättä vastaa in vivo havaittuja vaikutuksia. On myös tärkeää korostaa, että sieniuutteiden genotoksiset ja antigenotoksiset vaikutukset riippuvat lajista, pitoisuudesta ja niiden arvioinnissa käytetystä määrityksestä . Tuloksemme osoittivat, että kolmella Trametes-lajilla on erilainen kyky vähentää H2O2:n aiheuttamia DNA-vaurioita; esimerkiksi T. hirsuta -lajin hedelmärunkouutteella todettiin alhaisin aktiivisuus. Selvä käänteinen annos-vastesuhde DNA-vaurion tason ja uutepitoisuuden välillä havaittiin vain T. hirsuta basidiocarp -uutteessa. T. versicolorissa ja T. gibbosassa uutteen pitoisuuden nostaminen yli optimaalisen annoksen ei kuitenkaan parantanut komeettatuloksia, mikä vahvistaa Miyajin ym. tulokset. Nämä kirjoittajat osoittivat, että Lentinus edodes -uutteen pitoisuuksien ja niiden antigenotoksisen vaikutuksen välillä ei ole annos-vastesuhdetta. On tärkeää mainita, että uutteiden yhdistetyillä fenolisilla, flavonoidisilla ja muilla ainesosilla pitäisi olla suurempi potentiaali kuin uutteiden yksittäisillä ainesosilla, mikä osoittaa kaikkien ainesosien yhteisvaikutusten merkityksen. Tämä havainto voi johtaa Trametes spp:n antigenotoksisen aktiivisuuden erilaisiin suuntauksiin. Morales et al. osoittivat uutteen genotoksisen aktiivisuuden riippuvuuden määritystyypistä; he raportoivat, että Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus ja Pleurotus ostreatus -kasvien basidiokarppiuutteilla ei ollut mutageenista vaikutusta nisäkässoluihin Amesin Salmonella/mikrosomitestiä käyttäen. P. ostreatus -uutteella saatiin kuitenkin heikko aktiivisuus käyttämällä CHO/HPRT-testiä.

Sieniuutteiden antigenotoksisen vaikutuksen taustalla olevia mekanismeja ei vieläkään tunneta täysin. Uutteiden suojaavat vaikutukset näyttävät perustuvan useampaan kuin yhteen vaikutusmekanismiin, mikä ei Gebhartin mukaan ole harvinaista sienille. Antigenotoksisia mekanismeja voitaisiin arvioida käyttämällä esi- ja jälkikäsittelyjä eli erilaisia uutteiden ja H2O2:n yhdistelmiä. Positiiviset tuloksemme molemmissa käsittelyissä osoittavat, että uutteilla on suojaavia vaikutuksia sekä ennaltaehkäisy- että interventiotasolla ja että ne voivat toimia desmutageeneina ja bioantimutageeneina, mikä on osoitettu myös aiemmissa tutkimuksissa . Tässä tutkimuksessa havaittu esikäsittelyn tehokkuus voitaisiin selittää lisäämällä solujen antioksidanttikapasiteettia eli stimuloimalla antioksidanttisten entsyymien synteesiä ja aktiivisuutta oksidatiivisen stressin induktion aikana . Jälkikäsittelyn myönteinen vaikutus voisi olla seurausta interventiotoimien synergistisestä vaikutuksesta vapaiden radikaalien puhdistuksen ja antioksidanttisten entsyymien stimuloinnin kautta sekä DNA:n korjauksen kiihdyttämisestä, kuten Chiaramonte et al. ehdottivat . Koska nämä kirjoittajat raportoivat merkittävästä DNA-vaurioiden korjautumisesta 30-60 minuutin altistumisen jälkeen oksidatiiviselle aineelle, voidaan päätellä, että DNA:n korjautumisella ei ollut yhtä merkittävää roolia H2O2:lta suojautumisessa, koska jälkihoito-olosuhteissa otettiin huomioon enintään 30 minuutin inkubointi. Näin ollen Trametes spp. uutteiden genosuoiva vaikutus perustuu todennäköisesti antioksidanttisiin vaikutuksiin. Toisaalta tiedetään, että eukaryoottiset organismit ovat kehittäneet DNA-vauriovasteeksi kutsutun signaalireitin suojautuakseen genomin loukkauksilta. Gasser ja Raulet osoittivat, että DNA-vauriovaste hälyttää immuunijärjestelmän indusoimalla solupinnan ligandien ilmentymistä aktivoivalle immuunireseptorille NKG2D, jota luonnolliset tappajasolut (NK-solut) ja jotkin T-solut ilmentävät. Näin ollen Trametes spp.:n genosuoiva vaikutus genotoksisille aineille altistuneissa soluissa voisi moduloida DNA-vauriovastetta ja toimia esteenä varhaisessa kasvainten synnyssä. Jatkotutkimuksissa olisi analysoitava superoksididismutaasi- ja katalaasitasoja lymfosyyteissä, joita on käsitelty Trametes spp. uutteilla sekä ennen H2O2-käsittelyä että H2O2:n jälkikäsittelyn jälkeen, jotta voidaan vahvistaa oletus siitä, että kyseiset uutteet parantavat solujen antioksidanttikapasiteettia. Antioksidanttinen aktiivisuus

Testatut etanoliuutteet olivat hyviä antioksidantteja, mutta niiden aktiivisuus riippui lajista. Hedelmärunkouutteet osoittivat huomattavasti suurempia scavenging-vaikutuksia kuin myseeliuutteet (). Korkein DPPH-radikaalin puhdistusaktiivisuus havaittiin T. versicolor -uutteissa, sekä hedelmärungossa että myseelissä (63,5 % ja 59,4 %), mikä vahvistettiin EC50-arvoilla (15,22 mg ml-1 ja 16,18 mg ml-1). Hieman alhaisempi aktiivisuustaso havaittiin T. hirsuta -uutteilla (59,0 % basidiocarpsille ja 46,8 % myseelille), joiden pitoisuudet 17,06 mg ml-1 ja 21,81 mg ml-1 vastaavasti vähensivät radikaaleja 50 %. T. gibbosa oli laji, jolla oli alhaisin puhdistuspotentiaali, erityisesti myseeliuutteiden (39,7 %) EC50-arvon ollessa 26,15 mg ml-1. Hedelmärunkouutteen radikaalipuhdistuskyky ei kuitenkaan ollut merkittävästi pienempi verrattuna kahteen muuhun lajiin (53,7 % ja EC50-arvo 18,13 mg ml-1). Synteettisen antioksidantin BHA:n puhdistusaktiivisuus oli 94,28 %, ja pitoisuus 0,10 mg mL-1 tuotti 50 %:n vähennyksen.

Trametes-lajien hedelmärunko- ja myseeliuutteiden kokonaisfenolipitoisuudet poikkesivat toisistaan merkitsevästi () (taulukko 1). Yleisesti ottaen fenolipitoisuudet olivat hedelmärunkouutteissa korkeammat kuin myseeliuutteissa.

. Testatut lajit Urreuute Kokonaisfenolipitoisuus Kokonaisflavonoidipitoisuus (µg GAE/mg kuivattua uutetta) (µg QE/mg kuivattua uutetta) Trametes gibbosa Basidiokarppi 20.07 ± 1.24 7.63 ± 0.08 Mycelium 12.08 ± 0.87 1.76 ± 0.03 Trametes hirsuta Basidiokarppi 21.53 ± 2.36 8.28 ± 0.05 Mycelium 14.27 ± 0.92 2.21 ± 0.02 Trametes versicolor Basidiocarp 24.80 ± 0.42 10.79 ± 0.09 Mycelium 18.06 ± 0.33 4.16 ± 0.02

Taulukko 1

Kokonaisfenoli- ja flavonoidipitoisuudet valittujen Trametes-lajien etanoliuutteissa.

Kumpikin T. versicolor basidiocarp- ja T. versicolor mycelium -uute sisälsi eniten fenoleita ja flavonoideja, kun taas alhaisimmat pitoisuudet mitattiin T. gibbosa -uutteista. Fenoli- ja flavonoidipitoisuuksien perusteella T. hirsuta -uutteet sijoittuivat kahden muun lajin uutteiden väliin (taulukko 1). Korrelaatioaste uutteiden puhdistusaktiivisuuden ja fenoli- ja flavonoidipitoisuuksien välillä oli korkea, sillä hedelmäelinten osalta korrelaatio oli 0,98 ja 0,99 ja myseelin osalta 0,97 ja 0,99.

Aiemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet Trametes-lajien antioksidanttisen potentiaalin. Niinpä Kamiyama et al. osoittivat, että uutteen pitoisuus jopa 0,5 mg ml-1 scavenged lähes 50 % riippuen liuottimesta, kun taas Johnsy ja Kaviyarasana havaitsivat jopa 91,5 % radikaalien vähenemisen T. gibbosa basidiocarpsin metanoliuutteella pitoisuudella 1,0 mg ml-1 . Tutkimuksessamme testatuilla etanoliuutteilla oli hieman alhaisemmat kapasiteetit, mutta korkeammat kuin Sheikh et al. analysoimilla T. hirsuta -hedelmärunkouutteilla .

Mau et al. ja Palacios et al. mukaan fenoliset yhdisteet ovat avainasemassa antioksidatiivisessa aktiivisuudessa. Nämä yhdisteet ovat hyvin runsaita ja tärkeitä ainesosia sienien hedelmäelimissä ja myseeleissä. Niiden kyky perustuu hydroksyyliryhmien läsnäoloon, jotka toimivat pelkistävinä aineina, metallikelatoijina, singlettihapen vaimentajina ja vedyn luovuttajina. Joissakin tapauksissa niiden aktiivisuutta ei kuitenkaan voitu katsoa johtuvan uutteiden kokonaisfenolipitoisuudesta, mikä vahvistetaan vertaamalla tuloksiamme Johnsyn ja Kaviyarasanan tuloksiin. Nimittäin T. gibbosa basidiocarp -uute, joka sisälsi 23,8 μg GAE mg-1 -uutetta, vähensi 91,5 %, kun taas BEOFB 310 -kannan uute, jonka fenolipitoisuus oli 20,07 μg GAE mg-1 -uutetta, pelasti vain 63,5 % radikaaleista. Flavonoidien pitoisuus serbialaisessa T. gibbosa -kannassa oli kuitenkin huomattavasti korkeampi kuin Johnsyn ja Kaviyarasanan testaamassa kannassa (7,63 μg QE mg-1 uutteessa ja 0,59 μg QE mg-1 uutteessa), ja tämä voisi selittyä liuottimien erilaisilla polariteeteilla sekä kannan erilaisella kapasiteetilla flavonoidisynteesiin.

4. Johtopäätökset

Tutkimus oli ensimmäinen yritys arvioida T. versicolor-, T. hirsuta- ja T. gibbosa -uutteiden DNA:ta suojaavaa aktiivisuutta ja määrittää, perustuuko se niiden antioksidanttiseen potentiaaliin. Tulokset viittaavat siihen, että näiden kolmen lajin uutteita voitaisiin pitää vahvoina antigeenitoksisina aineina, jotka kykenevät stimuloimaan solujen genoprotektiivista vastetta, joka edistää immuunijärjestelmän tehostettua toimintaa, toksiinien poistamista ja vahvistamista, mikä viittaa perinteiseen käyttöön. Lisätutkimukset ovat kuitenkin tarpeen, jotta voidaan paljastaa antigenotoksisen aktiivisuuden spesifiset kantajat ja DNA:n suojaustapa hapettumisvaurioilta.

Interintäristiriita

Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja tämän artikkelin julkaisemiseen liittyen.

Kiitokset

Tekijät ilmaisevat kiitoksensa professori, tohtori Steve Quarrielle, joka on vierailevan professorin virkailija, joka työskentelee Newcastlen yliopistossa Yhdistyneessä Kuningaskunnassakin, englanninkielisen tekstin oikaisemisesta ja sen parantamiseksi. Tämä tutkimus toteutettiin Serbian tasavallan opetus-, tiede- ja teknologiaministeriön taloudellisella tuella, hanke nro 173032 ja hanke nro 173034.

.