top
- Overview
- Määritysmuodot
- Suodatusliigandinsitoutumismääritykset
- SPA-ligandin sitoutumiskokeet
- Yleiskatsaus ligandin sitoutumiseen
- Määritelmät
- Ligandien farmakologiset luokitukset
- Asiat
- Vinkkejä ja usein kysytyt kysymykset
- Muut PerkinElmerin reseptoriligandin sitoutumistekniikat
- Tilaustyönä valmistetut radionuklidin sitoutumismääritystapahtumat
Overview
Radioaktiivisia ligandeja käytetään yleisesti ligandin reseptoreihin sitoutumisen mittaamiseen. Tässä kokeessa mitataan radiomerkityn ligandin sitoutumista soluihin tai solukalvoihin, jotka sisältävät kiinnostavaa reseptoria. Tähän määritykseen voidaan käyttää sekä kokonaisia soluja että solukalvoja. Radioligandeilla voidaan tehdä saturaatiokäyriä, kilpailu- ja kineettisiä kokeita.
Ligandin ja reseptorin välinen sitoutuminen
Radioligandia valittaessa on muutamia tekijöitä, jotka on syytä pitää mielessä:
- Korkea spesifinen aktiivisuus: Radioligandit, joilla on korkea spesifinen aktiivisuus, soveltuvat hyvin ligandin sitoutumiskokeisiin. Spesifinen aktiivisuus ilmaisee, kuinka paljon radioaktiivisuutta on yhtä ligandimolekyyliä kohti, ja se ilmoitetaan yleensä yksikköinä Curie per millimooli ligandia. Useita 125I-leimattuja ligandejamme tarjotaan maksimaalisella spesifisellä aktiivisuudella (2200 Ci/mmol, jos käytettävissä on yksi 125I-leimauspaikka, 4400 Ci/mmol, jos käytettävissä on kaksi 125I-leimauspaikkaa jne.) Tämä tarkoittaa, että käytännössä jokainen varastopullossa oleva ligandimolekyyli on radioleimattu. Tritioiduille ligandeille (3H-ligandeille) olisi mieluiten valittava ligandi, jonka ominaisaktiivisuus on yli 20 Ci/mmol. Suurin teoreettinen spesifinen aktiivisuus tritiumia kohti on 29 Ci/mmol (Curies per millimooli tritiumia). Tämän arvon ylittävät spesifiset aktiivisuudet osoittavat, että keskimäärin jokaisella ligandimolekyylillä on vähintään yksi tritium.
- Vähäinen epäspesifinen sitoutuminen: Hydrofobisilla ligandeilla on yleensä suurempi epäspesifinen sitoutuminen. Tätä voidaan joskus kompensoida päällystämällä suodattimet BSA:lla epäspesifisen sitoutumisen vähentämiseksi. BSA:n, suolojen tai detergenttien lisääminen pesu- tai sitoutumispuskuriin voi myös vähentää epäspesifistä sitoutumista. Jos varastoradiokemikaali on pakattu silanoituun injektiopulloon (katso tekninen tietolomake), tämä voi viitata siihen, että ligandi on jonkin verran hydrofobinen
- Korkea puhtaus: Ihannetapauksessa ligandin radiokemiallisen puhtauden tulisi olla yli 90 %. Radiokemiallinen puhtaus vähenee ajan myötä, ja tämän hajoamisen todellinen nopeus kiihtyy ajan myötä. Eri radiokemikaaliemme radiokemiallinen puhtaus ja hajoamisnopeudet löytyvät eräkohtaisista teknisistä tiedoista.
- Korkea selektiivisyys: Mitä selektiivisempi ligandi on reseptorillesi, sitä paremmat tiedot saat. Korkea selektiivisyys tarkoittaa, että ligandi tunnistetaan enimmäkseen vain yhdestä kiinnostavasta reseptorista, eikä muista reseptoreista, joita saattaa olla solukalvolla. Myös sellaisten kalvojen käyttäminen, jotka yliekspressoivat kiinnostuksen kohteena olevaa reseptoria, voi auttaa vähentämään kalvossa endogeenisesti ilmentyneiden reseptorien mahdollista vaikutusta.
- Stabiilisuus: Jos joudut käyttämään radioligandia pitkän ajan kuluessa, stabiilisuus voi olla sinulle tärkeä tekijä. 125I-merkityt ligandit tulisi yleensä käyttää 1-2 kuukauden kuluessa valmistuspäivästä. Tritioidut ligandit tulisi yleensä käyttää 3-6 kuukauden kuluessa valmistuspäivästä; tästä on kuitenkin poikkeuksia. Hajoamisnopeudet ja valmistuspäivämäärät löytyvät eräkohtaisista teknisistä tiedoista. Beetaenergia vuorovaikuttaa tuikea-aineen kanssa tuottaen fotoneja, jotka detektori mittaa. 125I vapauttaa sekä beeta- että gammaenergiaa. Jos käytössäsi on vain gammamittari, käytä 125I:llä leimattua radioligandia. Lisätekijä on määritysmuoto. 125I vapauttaa enemmän beetatyyppistä energiaa kuin 3H. SPA-määrityksissä voidaan käyttää tehokkaasti joko 3H- tai 125I-merkittyjä ligandeja.
Radioaktiivisen ligandin sitoutumismäärityksiä voidaan tehdä useassa eri muodossa. Tyypillisesti suoritamme tämän määrityksen suodatusmuodossa, mutta määritys voidaan suorittaa myös SPA-muodossa. SPA-muoto on homogeeninen muoto, mikä tarkoittaa, että pesuvaiheita ei tarvita. Suodatusmäärityksessä sitoutumaton ligandi pestään pois tyhjiökeräimellä tai soluharvesterilla.
| SPA Assay | FlashPlate Assay | Filtration Assay | |
|---|---|---|---|
| Format | Homogeeninen | Homogeeninen | Pesu…based |
| Advantages |
|
|
|
| Haitat |
|
|
|
| Suositellaan | Matalan läpimenon määrityksiin (vain muutama määritys) tai suureen läpimenoon; automatisointi; syntyvän radioaktiivisen jätteen määrän vähentäminen | Matalan läpimenon (vain muutama määritys) tai suuren läpimenon; automatisointi; syntyvän radioaktiivisen jätteen määrän vähentäminen | Matalan läpimenon määritykset tai vain muutama koe; voi olla suotavaa, jos laboratoriosi on jo valmiiksi varustettu radioaktiivisia suodatusmäärityksiä varten |
Top
Määritysmuodot
Suodatusliigandinsitoutumismääritykset
Katsele lisätietoja siitä, mitä materiaaleja tarvitset, mitä optimointeja sinun on mahdollisesti tehtävä, ja referenssejä radioaktiivisia ligandeja sitoville suodatuslevyanalyyseille. Suodatusmuodossa sitoutumismääritys suoritetaan ensin yhdellä määrityslevyllä, jonka jälkeen se suodatetaan suodatinmaton tai UniFilter®-levyn läpi solunpoistolaitteen (tyhjiökeräin) avulla. Suodattimet pestään sitoutumattoman radioligandin poistamiseksi. Tämän jälkeen filtermat- tai UniFilter-levy kuivataan ja siihen lisätään tuikecocktail (tai Meltilex®) ennen lukemista sopivalla detektorilla.
SPA-ligandin sitoutumiskokeet
Katso lisätietoja siitä, mitä materiaaleja tarvitset, mitä optimointeja sinun on mahdollisesti tehtävä, sekä referenssejä SPA-radioligandinsitoutumiskokeisiin. SPA-muodossa solukalvot kiinnitetään SPA-helmiin. Kun radioligandi sitoutuu reseptoriin/membraaniin, radiokemikaali joutuu SPA-helmien läheisyyteen. Radioligandista peräisin oleva beetaenergia voi vuorovaikuttaa helmessä olevan tuikea-aineen kanssa, jolloin syntyy signaali, joka voidaan mitata. Radioligandi, joka ei ole sitoutunut solukalvoon, ei ole tarpeeksi lähellä SPA-helmeä, jotta se voisi vuorovaikuttaa voimakkaasti tuikean kanssa.
Yleiskatsaus ligandin sitoutumiseen
Määritelmät
- Affiniteetti (voimakkuus): Tiiviys, millä ligandi sitoutuu reseptoriin. Tämä ilmaistaan yleensä tasapainovakiona, Kd. Mitä pienempi Kd-arvo, sitä suurempi affiniteetti.
- Spesifisyys: kuvaa sitä, kuinka selektiivinen ligandi on yhdelle reseptorille vs. muille samanlaisille reseptoreille
- Kd: Pitoisuus, jossa 50 % reseptoreista on radioligandin valtaamia
Ligandien farmakologiset luokitukset
Ligandit
- Täysi agonisti: ligandi, joka sitoutuu reseptoriin ja aktivoi reseptorin ja saa aikaan maksimaalisen vasteen
- Osittainen agonisti: ligandi, joka sitoutuu reseptoriin ja saa aikaan submaksimaalisen vasteen
- Antagonisti: ligandi, joka sitoutuu reseptoriin, mutta ei aktivoi reseptoria. Antagonistit eivät aiheuta vastetta yksinään käytettynä. Ne estävät kilpailevan agonistiligandin vaikutuksen.
- Inversiagonisti: Ligandi, joka sitoutuu reseptoriin ja vähentää vastetta perustason alapuolelle
Asiat
I. Saturaatiokoe: Mittaa sitoutumistasapainoa suorittamalla radioligandin titraus pitämällä reseptorin määrä vakiona.
Kyllästyskäyrien avulla voit määrittää Bmax:n (reseptorin ilmentymistaso) ja Kd:n (ligandin sitoutumisaffiniteetti).
Saturaatiokokeilu
- Kokonaisvaltainen sitoutuminen: Radioligandin pitoisuuden lisääminen ilman kylmää ligandia. Mittaa sekä spesifistä sitoutumista reseptoriin että epäspesifistä sitoutumista.
- Epäspesifinen sitoutuminen: Lisätään radioligandin pitoisuutta kylmän ligandin läsnä ollessa. Mittaa radioligandin sitoutumista muihin kuin reseptorin komponentteihin.
- Spesifinen sitoutuminen: Kokonais- miinus ei-spesifinen sitoutuminen. Mittaa sitoutumista reseptoriin spesifisesti.
II. Kilpailukoe: Mittaa yhden radioligandikonsentraation tasapainositoutumista eri pitoisuuksina leimaamattoman kilpailijan läsnä ollessa.
Kilpailukäyrien avulla voidaan määrittää suuren määrän leimaamattomien yhdisteiden affiniteetti reseptoriin seulonnassa. IC50 ja Ki voidaan johtaa kilpailutiedoista.
Kilpailukäyrä
- IC50: Kilpailevan ligandin konsentraatio, joka syrjäyttää puolet radioaktiivisesta ligandista
- Ki: Kylmän ligandin affiniteetti reseptoriin
Huomautus: Radioligandin konsentraation muuttuessa voidaan havaita siirtymä referenssiyhdisteen IC50:ssä; Ki pysyy kuitenkin samana.
III. Kineettiset kokeet: Mitataan sitoutumisen taso eri aikoina radioligandin assosioitumisen ja dissosioitumisen nopeusvakioiden määrittämiseksi.
Kinetiikka
- Kyllästävä konsentraatio ligandia lisätty määrä sitoutuneena ajan kuluessa Kon
- Korkea konsentraatio leimaamatonta kilpailijaa lisätty. ja sitoutumisen väheneminen ajan kuluessa mitattuna Koff
Top
Vinkkejä ja usein kysytyt kysymykset
Ideaalisesti, haluat valita radioligandin, jolla on seuraavat ominaisuudet:
- korkea spesifinen aktiivisuus (> 20 Ci/mmol tritioidulle ligandille)
- matala epäspesifinen sitoutuminen (hydrofobisilla ligandeilla on yleensä korkeampi epäspesifinen sitoutuminen)
- korkea puhtaus (tyypillisesti > 90 %:n puhdas)
- korkea selektiivisyys
- kestävyys (jos radioligandia joudutaan käyttämään pidemmän ajan kuluessa, stabiilisuus voi olla tekijä. 125I-merkityt ligandit tulisi yleensä käyttää 1-2 kuukauden kuluessa valmistuspäivästä. Tritioidut ligandit tulisi yleensä käyttää 3-6 kuukauden kuluessa valmistuspäivästä (tästä on kuitenkin poikkeuksia).
Dataa piirtäessäsi suosittelemme käyttämään radioligandien työliuosten kokeellisesti määritettyä pitoisuutta lasketun pitoisuuden sijasta. Jotkin radioligandit tarttuvat laimennosputkien seinämiin. On tärkeää määrittää pipetoidun radioligandin todellinen pitoisuus. Voit määrittää radioligandin laimennoksen konsentraation kokeellisesti pipetoimalla muutaman mikrolitran laimennusputkesta ja tiputtamalla sen suodatinmatolle. Saatat myös haluta spotata 1/10-laimennoksen tästä näytteestä, jotta voit ristiintarkastaa tuloksesi. Määritä dpms (disintegraatioita minuutissa). Muunna dpms:stä Curieksi seuraavan yhtälön avulla:
1 Ci = 2,22 x 1012 dpm
Käytä sitten erän radioligandisi spesifistä aktiivisuutta muuntaaksesi Curiesta mooleiksi. Määrittääksesi radioaktiivisen konsentraation tässä vaiheessa, jaa moolien määrä suodatinmattoon tiputtamallasi tilavuudella.
FAQs
Q. Mitä radioligandipitoisuutta minun pitäisi käyttää kyllästyskäyrää varten?
A. Suosittelemme yleensä valitsemaan 3-5 konsentraatiota Kd:n alapuolelle ja 3-5 konsentraatiota Kd:n yläpuolelle. Korkeimman konsentraation tulisi olla kymmenkertainen Kd:hen verrattuna.
Q.Mikä radioligandin konsentraatio tulisi valita kilpailevaa sitoutumista varten?
A. Radioligandia käytetään pienenä pitoisuutena, yleensä sen Kd-arvon kohdalla tai sen alapuolella. Jos spesifinen aktiivisuus on alhainen, voidaan käyttää Kd-arvon ylittävää konsentraatiota, mutta se ei saa koskaan olla saturaatiokonsentraatiossa tai sitä korkeammalla.
Q. Minkä tyyppistä ligandia minun pitäisi käyttää epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseksi kyllästyskäyrissäni?
A. Yleensä kannattaa valita ligandi, joka on erilainen kuin radioligandisi. Haluat syrjäyttää vain radioligandin spesifisen sitoutumisen reseptoriin. Sinun tulisi valita ligandi, jolla on korkea affiniteetti reseptorin sitoutumiskohtaan ja alhainen affiniteetti epäspesifisiin sitoutumiskohtiin.
Top
Top
Muut PerkinElmerin reseptoriligandin sitoutumistekniikat
- DELFIA fluoresoivien reseptoriligandien sitoutumismääritykset
Top
Top
Top
Tilaustyönä valmistetut radionuklidin sitoutumismääritystapahtumat
Top
Radionuklidin sitoutumismäärityst, Membranes, Frozen Cells, and Receptors
PerkinElmer tarjoaa räätälöityjä radiokemikaaleja, räätälöityjä solulinjoja ja kalvoja, räätälöityjä mikrolevyjä, SPA-helmiä ja FlashPlates-levyjä sekä räätälöityjä määrityskehityksiä. Jos olet kiinnostunut räätälöidyistä palveluista, ota yhteyttä räätälöintitiimiimme:
ON>POINT® Custom Assay Development Services
Top
Vastaa