Tulokset ja keskustelu
Transkriptiotekijä NF-κB:n substitutiivista aktivaatiota pidetään välttämättömänä B-solujen transformaatiolle API2-MALT1-fuusioproteiinilla MALT-lymfoomissa, joissa on translokaatio t(11;18) . API2-MALT1:n transientti yliekspressio 293T-soluissa johtaa NF-κB-luciferaasireportterigeenin voimakkaaseen aktivoitumiseen, mikä tarjoaa hyödyllisen mallijärjestelmän niiden mekanismien tutkimiseen, joilla API2-MALT1 signaloi NF-κB:lle. Transfektiotehokkuuden seuraamiseksi me ekspressoimme pEGFP-N2:ta (Clontech) useissa kokeissa. Yllätykseksemme havaitsimme, että EGFP esti API2-MALT1:n indusoiman NF-κB-aktivaation annosriippuvaisesti (kuva 1A). Sitä vastoin EGFP ei vaikuttanut NF-κB:n p50/p65-alayksiköiden ilmentämisen indusoimaan reportteriaktivaatioon (Kuva 1B), mikä viittaa siihen, että API2-MALT1:n aktivoima NF-κB:n yläjuoksulla oleva NF-κB:n signalointikaskadi häiritsee NF-κB:n toimintaa.
- PowerPoint-dia
- suurempi kuva
- alkuperäinen kuva
(A) EGFP estää annosriippuvaisesti NF-κB-luciferaasireportterin aktivoitumisen Flag-tagatulla API2-MALT1-fuusioproteiinilla.
(B) EGFP ei estä NF-κB:stä riippuvaista luciferaasiaktiivisuutta, joka indusoituu NF-κB:n p50/p65-alayksiköiden ilmentymisestä (C) NF-κB-luciferaasireportterin aktivoituminen Flag-API2- MALTALT-lippukkeella.MALT1 estää EGFP, joka on mutatoitu TRAF6:n sitoutumismotiiviin (D) EGFP mutta ei pmaxGFP estää TNF-α:n indusoiman NF-κB-luciferaasireportterin aktivoitumisen ja IκB-α:n ja JUNin fosforylaation 293T-soluissa.
EGFP ei lisää HSP70-tasoja eikä indusoi HSP70B′:tä 293T-soluissa.
Fluoresenssin intensiteetit (Ex485/Em520nm) EGFP:lle ja pmaxGFP:lle olivat kumpikin ∼100-kertaisia taustaan verrattuna. (E) N- ja/tai C-terminaaliset EGFP-fuusioproteiinit (API2:lle, CHIC2:lle, NXF5a:lle, NXF1:lle, MALT1:lle, aktiinille, Rab5:lle, syndekaania sitovalle proteiinille 2 (Syndecan binding protein 2, SDCBP2) tai β-tubuliinille) ja EGFP, jossa on ydinalueen lokalisointisignaali (NLS) tai farnysilisaatiokohta (pEGFP-F), vähentävät TNF-α:n indusoimaa NF-κB:n lusiferaasirekisteröintiaktiviteettiä 293T:n soluilla. Pohja: Ihmisillä HSP70 ilmentyy konstitutiivisesti normaalioloissa, mutta Hsp70B′ indusoituu vain stressin vaikutuksesta.
Hsp70B′:llä ei ole basaalista ilmentymistä.
HSP70B′:n ilmentymisen positiivisena kontrollina 293T-soluja (kaista 2) lämpöshokattiin 44 °C:ssa kahden tunnin ajan (kaista 3) ja niiden annettiin toipua 37 °C:ssa 5 (kaista 4) tai 18 (kaista 5) tuntia ennen sadonkorjuuta. NF-κB:stä riippuvainen luciferaasiaktiivisuus esitetään kunkin kokeen osalta moninkertaisena induktiona vektoritransfektoituihin soluihin nähden, ja se esitetään graafisesti vähintään kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ja keskihajontana.
Kaikki molekyylipainostandardit ovat kDa:na.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 on oleellinen signaalinantoelementti antigeenireseptorireitillä NF-κB:n suuntaan , . Uskotaan, että BCL10 välittää MALT1:n oligomerisaatiota, mikä mahdollistaa kompleksin muodostamisen TRAF6:n kanssa. TRAF6:n oliligomerisaatio saa aikaan sen RING-domeenin E3-ubikitiiniligaasiaktiivisuuden, mikä johtaa IKKγ:n (NEMO) modifikaatioon Lys63-sidonnaisten polyubikitiiniketjujen kautta. Tämä helpottaa sitten IKKγ:n vuorovaikutusta TGFβ:n aktivoivan kinaasi 1:n (TAK1) kanssa, joka aktivoi täysin IκB-kinaasikompleksin (IKK) IKKβ:n fosforylaation kautta, mikä johtaa NF-κB:n aktivoitumiseen. Vastaavasti API2-MALT1-fuusioproteiini aktivoi NF-κB:n IKKγ:n TRAF6-välitteisen polyubikvitinaation kautta. TRAF6:n vuorovaikutus MALT1:n karboksiterminaalin kanssa tapahtuu kahden mahdollisen TRAF6:n sitoutumismotiivin kautta (PxExxAr/Ac, jossa Ar/Ac tarkoittaa aromaattista tai hapanta jäännöstä . EGFP-sekvenssin tarkastelu paljasti TRAF6:n sitoutumiskonsensuksen (PNEKRD, AA 212-217). EGFP:n kiderakenne osoittaa, että PNEKRD-motiivi paljastuu silmukassa kahden beetalehden välissä, mikä viittaa sen saavutettavuuteen ja EGFP:n rooliin negatiivisena säätelijänä TRAF6:n sitomisen kautta. Co-IP-kokeet eivät kuitenkaan osoittaneet EGFP:n ja TRAF6:n välistä vuorovaikutusta (tietoja ei ole esitetty), ja TRAF6:n sitoutumiskonsensusta koskevat mutantit estivät NF-κB:n aktivoitumisen API2-MALT1:n vaikutuksesta yhtä tehokkaasti kuin EGFP (kuva 1C).
Tullaksemme selville, oliko vaikutus rajoittunut API2-MALT1:een, analysoimme TNF-α:n indusoimaa NF-κB:n aktivoitumista EGFP:tä ekspressoivissa 293T-soluissa. Jälleen EGFP vähensi NF-κB-signalointia, mikä näkyi alhaisempana reportteriaktiivisuutena ja NF-κB:n estäjän, IκB-α:n, vähentyneenä fosforylaationa (kuva 1D). Seuraavaksi arvioimme, voisiko EGFP-fuusioproteiineilla olla sama vaikutus. Sekä N- että C-terminaaliset EGFP-fuusiot estivät API2-MALT1- (tietoja ei ole esitetty) ja TNFα:n indusoiman NF-κB-aktivaation (kuva 1E). Sen lisäksi, että TNF-α-hoito aktivoi NF-κB-reittiä, se käynnistää myös JNK-signalointia. JUN:n fosforylaatio, joka viittaa aktivoituneeseen JNK-signalointiin, vähenee myös EGFP:llä TNF-α-hoidon jälkeen (kuva 1D).
On raportoitu, että GFP:tä ilmentävien solujen pitkäaikainen visualisointi indusoi reaktiivisten happilajien tuotantoa, mikä voi johtaa fysiologisiin muutoksiin ja lopulta solukuolemaan . Mielenkiintoista oli, että molemmat EGFP-mutantit TRAF6:n sitovan konsensuksen osalta olivat menettäneet vihreän fluoresenssinsa, mutta estivät tehokkaasti NF-κB-signalointia (kuva 1C). Lisäksi pmaxGFP (Amaxa Biosystems), rakenteellisesti erilainen fluoresoiva proteiini, ei vaikuttanut NF-κB:n ja JNK:n aktivoitumiseen TNF-α-käsittelyn yhteydessä (kuva 1D), mikä viittaa siihen, että inhibitio ei johtunut vapaiden radikaalien aiheuttamasta fototoksisuudesta. Toisessa tutkimuksessa osoitettiin, että korkeat EGFP-pitoisuudet voivat indusoida lämpösokkiproteiini 70:tä (HSP70) , joka pystyy estämään NF-κB:n aktivaatiota vuorovaikutuksen kautta IKKγ:n ja TRAF6:n kanssa. HSP70:n induktio rajoittui kuitenkin endoteelisoluihin, emmekä havainneet lisääntyneitä HSP70-tasoja tai HSP70B′:n induktiota EGFP:tä ilmentävissä 293T-soluissa (kuva 1D-E).
NF-κB:n aktivoituminen API2-MALT1:n ilmentymisen tai TNF-α-hoidon yhteydessä liittyy IKKγ:n modifikaatioon TRAF6:n tai TRAF2:n toimesta Lys63:een sidotuilla polyubikvitiineillä , vastaavasti . Lisäksi TNFα:n indusoima JNK-signalointi edellyttää TRAF2:n auto-ubikitinaatiota . Arvioidaksemme EGFP:n mahdollista vaikutusta TRAF6:n tai TRAF2:n RING E3-ubikitiiniligaasiaktiivisuuteen seurasimme ubikitinaatiota HA-merkityn ubikitiinimutantin avulla, jossa vain Lys63 on polymerisaation käytettävissä (HA-Ub-K63). API2-MALT1:n ilmentäminen tai TNF-α-stimulaatio lisäsi polyubikititoituneiden proteiinien määrää 293T-soluissa, ja siihen liittyi lisääntynyt IKKγ:n polyubikitinaatio immunoprezipitaateissa, ja molemmat prosessit estettiin EGFP:llä (kuva 2A, kaistat 1,2,5,6). Lisäksi EGFP vähensi K63-sidonnaisen polyubikitinaation perustasoa 293T-soluissa (kuva 2A, kaistat 3 ja 4). Vastaavasti API2-MALT1:n ilmentäminen tai TNFα-hoito stimuloi K48-sidonnaisten ubikitiiniketjujen kasautumista, jonka EGFP ja sen rakenteellinen homologi dsRed (Clontech) taas estävät, mutta ei pmaxGFP (Kuva 2B).
- PowerPoint-dia
- suurempi kuva
- alkuperäinen kuva
(A) 293T-solut, jotka transfektoitiin ilmoitetuilla konstruktioilla ja joita käsiteltiin 4 tuntia 20 ng/ml TNF-α:lla (kaistat 5 ja 6), immunoblotattiin anti-Flag- (API2-MALT1), anti-HA- (HA-Ub-K63) ja anti-EGFP-vasta-aineilla (vasen paneeli) tai anti-IKKγ-immunoprecipitaatit immunoblotattiin anti-IKKγ-immunoprecipitaatilla anti-Flag- (IKKγ-) tai anti-HA-immunoprecipitaatilla anti-Flag-vasta-aineilla tai anti-IKKγ-vasta-aineilla immunoblotattiin anti-IKKγ-vasta-aineilla tai anti-IKKγ-vasta-aineilla anti-IKKγ-vasta-aineilla immunoprecipitaattien immunoprecipitaattien immunoprytmissä immunoblotattua immunoprytmiä käyttäen.
(B) EGFP vaikuttaa K48-sidonnaiseen polyubikitinaatioon.
293T-solut transfektoitiin Ubikitiinikonstruktiolla, jossa vain Lys48 oli käytettävissä polymerisaatioon (HA-Ub-K48), niitä käsiteltiin 4 tuntia 20 ng/ml TNF-α:lla tai ne jätettiin käsittelemättä, ja solulysaatit immunoblottailtiin anti-HA (Ub-K48) ja anti-EGFP-vasta-aineilla.
Fluoresenssin intensiteetit (eksitaatio 485 / emissio 520 nm) EGFP:lle ja pmaxGFP:lle olivat vertailukelpoisia (∼100-kertaisesti korkeammat kuin tausta-arvot), pDs-Redin ilmentyminen vahvistettiin fluoresenssimikroskopialla.
(C) EGFP stabiloi eksogeenisen API2-Myc:n 293T-soluissa vähentämällä sen Lys48-sidonnaista auto-ubikvitinaatiota ja proteasomaalista hajoamista.
(D) EGFP:n vakaa ilmentyminen merkelisolusyöpäsolulinjassa MCC14.2 vähentää polyubikitinaatiota ja lisää endogeenisen p53:n ilmentymistasoja.
Annetaan p53:n ja aktiinin signaalien keskimääräinen suhde ja keskihajonta (kolme riippumatonta koetta), (Ub)n : polyubikitinoidut proteiinit.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Tutkiaksemme, vaikuttaako EGFP yksinomaan TRAF-proteiinien ubikitinaatioon, arvioimme API2:ta, RING E3-ubikitiiniligaasia, joka destabiloituu itseään Lys48-sidonnaisen auto-ubikitinaation kautta . EGFP:n yhteisekspressio esti API2:n indusoiman polyubikitinaation 293T-soluissa, mikä johti API2:n ilmentymistasojen nousuun (kuva 2C). Myös MCC14.2-soluissa, joissa oli vakaa EGFP:n ilmentymä, havaittiin vähentyneitä vakaan tilan ubikitinaatiotasoja. Tämän seurauksena endogeenisen p53:n perustasot, joita säädellään tiukasti MDM2:n Lys48-sidonnaisen ubikitinaation kautta, ovat hieman kohonneet EGFP:tä ilmentävissä soluissa (kuva 2D).
Seuraavaksi tutkittiin, vaikuttaako EGFP ubikitinaatioon in vivo. Polyubikitinaation perustasot olivat pienentyneet EGFP-siirtogeenisten hiirten pernan lymfosyyteissä , mikä liittyi vähentyneeseen IκB-α:n fosforylaatioon antigeenistimulaation jälkeen verrattuna kontrollihiiriin, mikä osoittaa, että EGFP vähentää B-solureseptorin indusoimaa NF-κB-aktivaatiota (Kuva 3A-B). API2-MALT1-transgeenisillä hiirillä on luuytimessä B220+/CD40+ B-solujen vaje, koska API2-MALT1-välitteinen NF-κB-aktivaatio kiihdyttää niiden kypsymistä naiiveiksi B-soluiksi . Kun nämä API2-MALT1-transgeeniset hiiret risteytettiin EGFP-hiirten kanssa, B220+/CD40+ B-solujen vaje EGFP/API2-MALT1-kaksoistransgeenisten hiirten luuytimessä palautui (kuva 3C), mikä tukee entisestään vaikutusta ubikitinaatioon ja NF-κB-signaalin välittämiseen in vivo. Vastaavasti polyubikitinaatio väheni EGFP-hiirten maksasoluissa, ja se liittyi p53:n stabiloitumiseen, kuten sen ilmentymistason nousu osoitti (Kuva 3A, D). P53:n tärkein kohdegeeni γ-säteilyn aiheuttaman DNA-vaurion yhteydessä maksassa on p21, jota tarvitaan solusyklin pysähtymiseen ja DNA:n korjaamiseen . Näin ollen γ-säteilyn aiheuttama DNA-vaurio aiheutti EGFP-hiirissä suuremman p53-vasteen lisäksi myös p21:n induktio oli hieman tehostunut (kuva 3D). Lopuksi tehtiin in vitro -kokeet sen arvioimiseksi, vaikuttaako EGFP suoraan ubikitiiniketjujen kokoonpanoon; rekombinantti EGFP ei kuitenkaan vaikuttanut kontrollisubstraatin polyubikitinaatioon (Kuva 3E), mikä viittaa EGFP:n solukontekstista riippuvaan vaikutukseen ubikitinaatioon.
- PowerPoint-dia
- suurempi kuva
- alkuperäinen kuva
(A) Western blotit FVB-villityypin (wt) ja EGFP-transgeenisten hiirten perna- ja maksauutteista, jotka on havaittu vasta-aineilla Ubikitiinia, EGFP:tä ja aktiinia (latauskontrolli) vastaan.
(B) EGFP vähentää IκB-α:n fosforylaatiota anti-IgM/anti-CD40-stimuloiduissa B-lymfosyyteissä, jotka on puhdistettu EGFP-hiiristä.
Kokeet on tehty kolmena kappaleena, kuvassa on edustava kuva yhdestä kokeesta.
Keskiarvot ja keskihajonnat IκB-α-P:n ja aktiinin välisistä suhteista suhteessa stimuloimattomiin soluihin on esitetty.
(C) B220+/CD40+ B-solujen vaje API2-MALT1-hiirten luuytimessä palautuu EGFP/API2-MALT1-kaksoistransgeenisillä hiirillä.
Kokeet on tehty kolmena kappaleena, keskiarvo ja keskihajonnat on esitetty. eMalt1: endogeeninen Malt1, *a-spesifinen kaista (D) EGFP-hiirillä p53-pitoisuudet maksassa ovat kohonneet ja p53/p21-vasteet ovat tehostuneet γ-säteilyn aiheuttaman DNA-vaurion yhteydessä.
Annetaan p53/p21- ja aktiinisignaalien suhteiden keskiarvot ja keskihajonnat suhteessa näytteeseen 1.
(E) Rekombinantti EGFP (rEGFP) ei estä biotiini-Lysotsyymisubstraatin polyubikitinaatiota in vitro. (Ub)n: polyubikitinoidut proteiinit.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tietomme osoittavat, että EGFP- ja EGFP-fuusioproteiinit vaikuttavat RING E3-ubikitiiniligaasista riippuvaisiin prosesseihin, kuten NF-κB- ja JNK-signalointiin tai p53:n homeostaasiin solulinjoissa ja hiirissä. NF-κB:llä on keskeinen rooli erilaisten biologisten prosessien säätelyssä, mukaan lukien synnynnäinen ja adaptiivinen immuniteetti, kehitys, solujen kasvu ja selviytyminen . Eloonjäämistä edistävät signaalit johtuvat apoptoosin estäjien, kuten B-soluleukemian/lymfooman-XL:n, kohonneesta ilmentymisestä. EGFP:n aiheuttama apoptoosin lisääntyminen soluissa tai hiirten aivojen motorisessa aivokuoressa ja striatumissa saattaa siis liittyä vähentyneeseen NF-κB:n aktiivisuuteen, joka johtuu sen ylempänä olevien säätelijöiden puutteellisesta polyubikitinaatiosta ja aktivoinnista/hajoamisesta. Puutteellisen ubikitinaation oletetaan myös aiheuttavan raajojen vyötärölihasten dystrofiaa, joka liittyy mutaatioihin Trim32:ssa, joka on aktiinin ubikitiiniligaasi. Koska EGFP:n osoitettiin heikentävän aktiini-myosiini-interaktioita lihassoluissa ja aiheuttavan laajentunutta kardiomyopatiaa EGFP-hiirissä , on houkuttelevaa spekuloida, että aktiiniubikitinaatiolla saattaa olla olennainen rooli lihaksen normaalissa toiminnassa ja että EGFP:n aiheuttama sen deregulaatio aiheuttaa edellä mainittuja fenotyyppejä. Kun otetaan huomioon ubikitinaation nouseva rooli lukuisissa soluprosesseissa, EGFP:n käyttöä elävien solujen reportterina olisi harkittava huolellisesti.
Vastaa