Oksidatiivis-fermentatiivisen (OF) testin kehittivät Hugh ja Leifson vuonna 1953. He kehittivät OF-median erottamaan toisistaan hapettavat bakteerit (jotka tuottavat hiilihydraateista happoa vain aerobisissa olosuhteissa) ja fermentatiiviset bakteerit (jotka tuottavat happoa sekä aerobisissa että anaerobisissa olosuhteissa).
Sakkarolyyttiset mikro-organismit hajottavat glukoosia joko fermentatiivisesti tai hapettavasti. Fermentaation lopputuotteet ovat suhteellisen voimakkaita sekahappoja, jotka voidaan havaita tavanomaisessa fermentaatiotestialustassa. Glukoosin oksidatiivisessa hajoamisessa muodostuvat hapot ovat kuitenkin erittäin heikkoja ja vähäisempiä, ja havaitsemiseen tarvitaan Hughin ja Leifsonin OF-mediaa herkempi hapetusfermentaatiomedium. Väliaine valmistettiin lisäämällä glukoosin määrää fermentaation havaitsemiseen käytettävässä väliaineessa esiintyvää määrää suuremmaksi ja vähentämällä peptonin määrää.
Hughin ja Leifsonin OF-media eroaa hiilihydraattikäymismediasta seuraavasti:
- Agarin pitoisuutta on vähennetty 2 prosenttiin 3 prosentista, mikä tekee siitä koostumukseltaan puolikiinteän (tämä auttaa organismin liikkuvuuden määrittämisessä).
- Peptonin pitoisuutta on vähennetty 11 prosentista 2 prosenttiin. (vähennetään peptonin aineenvaihdunnassa syntyvän emäksisen tuotteen määrää; näin vähennetään näiden tuotteiden neutraloivaa vaikutusta).
- Hiilihydraattipitoisuutta nostetaan 0,5 %:sta 1:een.0 % (lisääntynyt glukoosikonsentraatio väliaineessa lisää näiden heikkojen happojen tuotantoa tasolle, joka voidaan havaita bromtymolinsininen-indikaattorilla.)
PERIAATE:
Hapettumis-fermentaatiotestillä määritetään, metabolisoivatko tietyt gramnegatiiviset sauvat glukoosia fermentoimalla vai aerobisesti hengittämällä (hapettamalla). Anaerobisen käymisprosessin aikana pyruvaatti muuttuu erilaisiksi sekahapoiksi käymistyypistä riippuen. Käymisen aikana syntyvien happojen suuri pitoisuus muuttaa OF-mediassa olevan bromtymolinsinisen indikaattorin vihreästä keltaiseksi hapen läsnäollessa tai poissa ollessa .
Tietyissä ei-fermentoivissa gramnegatiivisissa bakteereissa glukoosi metaboloituu aerobisen hengityksen avulla, minkä vuoksi ne tuottavat glykolyysin ja Krebsin syklin aikana vain pienen määrän heikkoja happoja. Peptonin määrän väheneminen ja glukoosin määrän lisääntyminen helpottaa näin tuotettujen heikkojen happojen havaitsemista. Dikaliumfosfaattipuskuria lisätään happojen havaitsemisen edistämiseksi entisestään.
Käyttökohteet:
OF-testiä käytetään sen määrittämiseen, metabolisoivatko gramnegatiiviset bakteerit hiilihydraatteja hapettamalla, fermentoimalla vai ovatko ne ei-saakrolyyttisiä (eivät kykene käyttämään elatusaineen hiilihydraattia).
Media:
Hughin ja Leifsonin OF-perusmedium; aineosat ovat seuraavat:
- Natriumkloridi : 5,0 g
- Dikaliumfosfaatti : 0,3 g
- Peptoni : 2.0 g
- Bromtymolisininen : 0.03 g
- Agar : 3.0 g
- Glukoosi : 10 g
- Vesi : 1000 ml
PH-arvo on säädettävä 7.1:een ennen autoklavointia. Kun elatusainetta on autoklavoitu 121 °C:ssa 15 minuutin ajan, elatusaineeseen lisätään aseptisesti suodatinsteriloitua 10-prosenttista hiilihydraattiliuosta siten, että loppupitoisuus on 1 %.
Menetelmä
- Inokuloidaan kaksi OF-koealustan putkea koe-organismilla suoraa rautalankaa käyttäen puukottamalla se ”puoliväliin putken pohjaa” myöten.
- Peitetään kummankin parin toinen putki 1 cm:n kerroksella steriiliä mineraaliöljyä tai nestemäistä parafiinia (se luo putkeen anaerobiset olosuhteet estämällä hapen diffuusion) ja jätetään toinen putki avoimeksi ilmalle.
- Inkuboidaan molempia putkia 35 °C:ssa 48 tuntia (hitaasti kasvavilla bakteereilla voi kestää 3-4 päivää, ennen kuin tuloksia voidaan havaita)
Tulkinta
Happotuotanto havaitaan elatusaineessa keltaisen värin ilmestymisestä. Hapettavien organismien tapauksessa; värintuotanto voidaan havaita ensin elatusaineen pinnan lähellä.
Seuraavat ovat reaktiomalleja:
- Fermentatiivinen tulos: Happotuotanto molemmissa (avoimissa ja katetuissa) putkissa. Tuotettu happo muuttaa pH-indikaattorin, bromtymolinsinisen, vihreästä keltaiseksi. esim. Escherichia coli
- Hapettava tulos: Happotuotanto avoimessa putkessa (aerobinen) eikä öljyllä peitetyssä putkessa (anaerobinen) osoittaa hapettavaa tulosta. Muut kuin fermentoivat bakteerit, jotka metaboloivat glukoosia oksidatiivisen metabolian kautta, antavat oksidatiivisen tuloksen. esim. Pseudomonas aeruginosa
- Ei sakkarolyyttinen (negatiivinen OF-tulos): Ei-sakkolyyttiset bakteerit antavat negatiivisen OF-tuloksen. Negatiivisen tuloksen osoittaa se, ettei väri muutu öljyn peittämässä putkessa ja joissakin tapauksissa pH:n nousu (pH 7,6), jolloin bromtymolisininen muuttuu vihreästä siniseksi avoimen putken yläosassa. pH:n nousu johtuu bakteerien amiinituotannosta, kun ne hajottavat elatusaineen peptonia (proteiinia).
e.g. Alcaligenes faecalis.
laadunvalvonta
- Glukoosifermentteri: Escherichia coli
- Lukoosin hapetin: Pseudomonas aeruginosa
- Ei-sakkarolyyttinen: Moraxella species
Vastaa