Nopea lateraalivirtausimmunomääritys SARS-CoV-2 RNA:n fluoresenssin osoittamiseksi

HC-FIA-järjestelmässä koettimen DNA:n funktionaaliset FNP:t vahvistavat viruksen RNA:n ja DNA:n hybridisaatiosignaalia koettimessa. HC-FIA-biosensorin suunnitteluperiaate on esitetty kuvassa 1.

a, HC-FIA:n periaate. b, Kuva 1, Edustavat tulokset sivuvirtausliuskalla. c, Fluoresenssianalyysilaite. d, Valokuva kannettavasta matkalaukkulaboratoriosta, jonka pituus on 55,5 cm, leveys 37 cm ja korkeus 23 cm ja paino 8,5 kg. e, HC-FIA-määrityksen testausprosessi. Vaihe 1: nukleiinihappojen hybridisointi inkubaattorissa vakiolämpötilassa. Vaihe 2: fluoresenssisignaalien voimakkuuden määrittäminen testikortilla käyttäen c-kohdassa esitettyä laitetta. f, Koettimen jakautuminen SARS-CoV-2:n genomissa.

HC-FIA-testin suunnittelu ja toiminta

Myrinen S9.6 monoklonaaliset vasta-aineet on esiliitetty sivuvirtausliuskan testiviivalle (T), ja kontrolliviiva (C) on päällystetty vuohen anti-kani IgG-polyklonaalisilla vasta-aineilla (kuva 1a). S9.6-vasta-aineilla ja kanin IgG:llä leimatut FNP:t asetetaan reaktioputkeen. Detektioprosessin alussa kurkkupyyhkäisynäytteessä tai ysköksenäytteessä oleva SARS-CoV-2 lysoituu ja vapautuu, ja vapautunut RNA hybridisoituu spesifisen SARS-CoV-2-DNA-koettimen kanssa. Syntynyt RNA-DNA-hybridi tarttuu FNP-merkittyihin S9.6-vasta-aineisiin, ja kompleksi virtaa näytetyynyä ja nitroselluloosakalvoa pitkin kapillaarivoimien vaikutuksesta absorptiopaperia kohti. Kun kompleksi kulkee T-alueen läpi, S9.6-vasta-aineet vangitsevat sen, mikä tuottaa vähitellen fluoresoivan signaalin. C-alueella FNP-merkitty kani IgG tarttuu anti-kani IgG:hen. Kohteena olevan SARS-CoV-2 RNA:n läsnäolo tai puuttuminen perustuu fluoresenssin intensiteetin raja-arvoon (kuvat 1b,c). Kuvassa 1d on esitetty kannettava matkalaukullinen laboratorio, joka pystyy antamaan laadullisia tuloksia alle tunnissa seuraavien kahden vaiheen jälkeen: hybridisaatio ja immunofluoresenssianalyysi (kuva 1e).

Tässä käytimme testifluoresenssisignaalin ja kontrollifluoresenssisignaalin suhdetta (T/C) lateraalivirtausliuskalla siten, että testikortin mahdollisen tausta-fluoresenssin vaikutus minimoitiin. Mittaamalla 211 terveeltä henkilöltä otettujen kurkunpyyhkäisynäytteiden T/C-suhteen havaitsimme, että keskimääräinen taustan T/C-suhde oli 49,95, ja sen s.d. oli 17,16 (täydentävä kuva 1a). Vastaanottimen toimintaominaiskäyrää (ROC) ja käyrän alle jäävää pinta-alaa (AUC) käytettiin raja-arvon määrittämiseen ja HC-FIA-määrityksen diagnostisen tarkkuuden arviointiin herkkyyden ja spesifisyyden perusteella eri raja-arvoilla. Määritimme ROC-käyrän, jonka AUC-arvo oli 0,999 ja 95 prosentin luottamusväli (CI) 0,997-1,000 (täydentävä kuva 1b), käyttäen kurkunpyyhkäisynäytteitä 100 kliinisesti vahvistetusta ja poissuljetusta COVID-19-tapauksesta. Suurimman herkkyyden ja spesifisyyden saavuttaneeksi raja-arvoksi määritettiin 102,07, mikä vastaa Youdenin indeksin pistettä 0,980. Vaihtoehtoisesti immunomäärityksissä käytetään yleensä raja-arvona kynnysarvoa, joka on kaksinkertainen negatiiviseen tausta-arvoon verrattuna (tässä 49,95 × 2 = 99,90). Yksinkertaisuuden vuoksi valitsimme T/C-kynnysarvoksi 100,00.

HC-FIA-määrityksen kehittäminen

DNA-koettimien optimointi SARS-CoV-2:n RNA-kohdesekvenssiä varten on avainasemassa määrityksen tehokkuuden parantamisessa. Luettelo kaikista suunnittelemistamme DNA-koettimen sekvensseistä on lisätaulukossa 1. SARS-CoV-2:n genomi käsittää noin 30 000 emästä, mukaan lukien vaihteleva määrä (6-11) avoimia lukukehyksiä (ORF). Ensimmäisen ORF:n osuus koko genomista on noin 67 prosenttia, ja se koodaa 16 ei-rakenteellista proteiinia sekä apuproteiineja ja rakenneproteiineja. Neljä tärkeintä rakenneproteiinia ovat piikkiglykoproteiini (S), pieni kuoriproteiini (E), matriisiproteiini (M) ja nukleokapsidiproteiini (N)15,16. Useimmissa SARS-CoV-2:n nukleiinihappojen osoittamismäärityksissä käytetään seuraavia kolmea konservoitunutta aluetta viruksen genomissa: ORF1ab, jossa sijaitsee RNA-riippuvainen polymeraasigeeni (rdrp)15, ja alueet, jotka koodaavat N:ää ja E:tä.

Aloitimme hakemalla SARS-CoV-2:n RNA-genomisekvenssin National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) GenBankista (liittymisnumerot MN908947, MN908947.3, MN908947.2 ja NC_045512.1). SARS-CoV-2:n genomin muiden julkaistujen sekvenssien yksityiskohtainen analyysi ei paljastanut merkittävää vaihtelua näillä alueilla. Suunnitteluohjelmisto Primer Premier 5.0:n avulla suunnittelimme kolme koetinta kutakin kolmea aluetta varten: CoV01 ja CoV04, jotka sijaitsevat ORF1ab:n ja N:n havaitsemiseen suositellulla alueella, ja CoV08, joka sijaitsee samalla alueella kuin E17. Koettimien sitoutumiskohtien genomipaikat referenssigenomisekvenssissä (NC_045512.2) on merkitty kuvaan 1f.

Suunniteltujen DNA-koettimien ja ihmisen genomista sekä virusten, bakteerien, mykoplasman, klamydian ja muiden yleisten patogeenien genomeista peräisin olevien sekvenssien välillä tehtiin sekvenssikohdistus. Koettimet vastasivat ainoastaan SARS-CoV-2:n genomisekvenssiä, emmekä löytäneet homologiaa ihmisen genomisen DNA:n kanssa. Positiivisina kontrolleina käytettiin pseudoviruksia, jotka kantavat kohdegeenin eri alueita ja jotka on rakennettu käyttäen lentiviruksia vektoreina. Käytettyjen pseudovirusten kohdegeenisekvenssit esitetään lisätaulukossa 2. P1 oli positiivinen SARS-CoV-2:n N-alueelle, P2 SARS-CoV-2:n E-alueelle ja P3 SARS-CoV-2:n ORF1ab-alueelle. Kolmen positiivisen kontrollin pitoisuus oli 3 000 transduktioyksikköä (TU) ml-1, mikä tarkoittaa, että infektiivisiä viruspartikkeleita oli 3 000 kappaletta millilitrassa. N1-N17:n negatiivisina kontrolleina käytettiin fysiologista keittosuolaliuosta, puhdistettua vettä ja nielun pyyhkäisynäytteitä, jotka olivat positiivisia muille yleisille patogeeneille. Luettelo tutkimuksessa käytetyistä positiivisista ja negatiivisista referensseistä on lisätaulukossa 3. Testitulokset esitetään lisätaulukoissa 4-6. ORF1ab-alueelle valittiin koettimet CoV01 ja CoV03, E-alueelle koetin CoV08 ja N-alueelle koettimet CoV04 ja CoV06 sitoutuivat ensisijaisesti kohde-RNA:han. Valitut DNA-koettimet optimoitiin edelleen yhdistelemällä (lisätaulukko 7) siten, että kukin koettimien ryhmä kohdistui samanaikaisesti kaikkiin kolmeen segmenttiin. Täydentävässä taulukossa 8 esitetyt HC-FIA-testin tulokset osoittavat, että Cov01-, Cov04- ja Cov08-koettimien yhdistelmä (ryhmä 2) erotti kaikki positiiviset kontrollinäytteet negatiivisista kontrolleista ja havaitsi positiiviset näytteet, joiden virustitteri oli alhainen (1 000 TU ml-1; täydentävä taulukko 3, L1-L3), yli 95 prosentin positiivisella osuudella. Ryhmä 2 valittiin sen vuoksi lopulliseksi yhdistelmäksi. Tähän mennessä NCBI:ssä on julkaistu 13 411 SARS-CoV-2:n nukleotidisekvenssiä. Kolmen koettimen kohdistaminen vastaavaan kohdealueeseen 13 411 ladatussa sekvenssissä osoitti, että koettimien kohdealueet olivat riittävän konservoituneita, jotta niiden samankaltaisuus oli 100 %.

Optimoimme myös määrityksen testausolosuhteet, erityisesti hybridisaation inkubaatioajan ja testiliuskan lukemisajan. Testin suorituskyky inkubaatioajoilla 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min ja 60 min 56 °C:ssa on esitetty lisätaulukossa 9. Huomattakoon, että 20 minuuttia riitti DNA-koettimien hybridisoitumiseen kohdealueen kanssa, mikä näkyi 100-prosenttisena positiivisena osuutena positiivisten kurkunpyyhkäisynäytteiden ja ysköksenäytteiden havaitsemisessa alhaisella virustitterillä (1 000 TU ml-1; lisätaulukko 3, L1-L3). Kun inkubaatioaikaa pidennettiin 50 tai 60 minuuttiin, reaktio ei ollut yhtä vakaa, sillä L1-L3-vertailunäytteiden positiivinen osuus laski. Ottaen huomioon havaitsemisen tehokkuuden ja viruksen inaktivointia koskevan vaatimuksen valitsimme hybridisaation inkubaatioajaksi 56 °C:ssa 30 minuuttia. Arvioimme myös liuskan lukuaikaa arvoilla 10 min, 12 min, 15 min ja 18 min (lisätaulukko 10). Tulokset osoittivat, että 12 min tai pidempi aika johti positiivisten ja negatiivisten vertailunäytteiden oikeaan havaitsemiseen. Variaatiokerroin (CV) oli kuitenkin alle 10 prosenttia positiivisten näytteiden, joiden virustitteri oli alhainen, havaitsemisessa vain käytettäessä 15 minuutin lukuaikaa. Siksi valitsimme 15 minuutin lukemisajan.

Guanidiniumtiosyanaattia ja guanidiinikloridia – yleisimmin käytettyjä proteiinien denaturointiaineita nukleiinihappojen uuttamisessa – verrattiin näytteiden säilytykseen käytettäviksi kuljetusvälineiksi. Guanidiniumtiosyanaatti johti parempaan suorituskykyyn positiivisten ja negatiivisten näytteiden erottamisessa, ja CV oli suhteellisen alhainen näytteissä, joissa virustitteri oli alhainen. Guanidiniumtiosyanaatti jopa 6 mol l-1 pitoisuutena on osoittanut erinomaisia antiviraalisia ominaisuuksia18. Valitsimme guanidiniumtiosyanaatin pitoisuutena 5 mol l-1 proteiinien denaturointiaineeksi viruksen inaktivoimiseksi kuljetusalustassa.

HC-FIA-määrityksen spesifisyys

Optimoituamme koettimien sekvenssit ja reaktio-olosuhteet tutkimme HC-FIA-määrityksen spesifisyyttä SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi. Positiiviset kontrollit sisälsivät kohdegeeneillä varustettuja pseudoviruksia (näytteet P1-P3) ja viisi kliinistä kurkunpyyhkäisynäytettä (näytteet P4-P8), jotka vahvistettiin RT-qPCR-pohjaisella nukleiinihappojen osoitussarjalla (Shanghai ZJ Bio-Tech). Negatiiviset kontrollit, jotka koostuivat kurkunpyyhkäisynäytteistä, olivat negatiivisia SARS-CoV-2:n suhteen ja positiivisia influenssa A:n, influenssa B:n, hengitystieinfektioviruksen, klamydia pneumoniae:n, adenoviruksen tai muiden taudinaiheuttajien suhteen (näytteet N5-N17) tai pseudoviruspositiivisia MERS:n (näyte N18) tai SARS:n (näyte N19) N-alueen suhteen. Luettelo kaikista näytteistä on lisätaulukossa 3. Luettelo 8 positiivisen referenssinäytteen ja 15 negatiivisen referenssinäytteen toteamistuloksista on lisätaulukossa 11.

Tutkimme, oliko SARS-CoV-2:n ja 55 yleisen hengitystiesairauksia aiheuttavan patogeenin välillä ristireaktiivisuutta. Kunkin patogeenisen mikro-organismin lähde- ja kvantitatiiviset tiedot on esitetty lisätietoaineistossa 1. Alkuperäinen virustitteri määritettiin 106:ksi plakkia muodostavaksi yksiköksi millilitrassa käyttäen plakkimääritystä. Bakteerien, mykoplasman ja klamydian häiriönäytteiden pitoisuustaso oli 107 pesäkettä muodostavaa yksikköä millilitrassa. Lisäksi ihmisen genomista DNA:ta uutettiin ja määritettiin määrällisesti 90-105 µg ml-1 kolmesta kokoverinäytteestä. HC-FIA-määritys osoitti erinomaista spesifisyyttä SARS-CoV-2:lle, eikä sillä ollut ilmeistä ristireaktiivisuutta kaikkien muiden patogeeninäytteiden ja ihmisen genomisen DNA:n kanssa (Supplementary Dataset 1).

Koska monoklonaalinen vasta-aine S9.6 sitoutuu myös RNA-RNA-duplekseihin19 ja erityisesti AU-rikkaisiin duplekseihin20 , suunnittelimme kaksisäikeisiä RNA-sekvenssejä, joissa oli vaihteleva AU-fraktio. Yksityiskohtaiset sekvenssitiedot ovat lisätaulukossa 12. Kuten lisätaulukosta 13 käy ilmi, HC-FIA-määrityksessä ei AU-pitoisuudesta riippumatta havaittu havaittavaa positiivista signaalia kaksisäikeisen RNA:n suhteen, mikä osoittaa, että S9.6-vasta-aineen ja kaksisäikeisen RNA:n välinen sitoutumisaffiniteetti on alhainen määritysolosuhteissa. Tutkimme myös, vaikuttaako kaksisäikeisen RNA:n läsnäolo määrityksen suorituskykyyn kliinisten kurkkupyyhkäisy- tai ysköksenäytteiden osoittamisessa. Käytimme 2 positiivista kurkunpyyhkäisynäytettä, 2 positiivista ysköksenäytettä, 10 negatiivista kurkunpyyhkäisynäytettä ja 5 negatiivista ysköksenäytettä. Mittasimme T/C-suhteet suhteessa häiriöttömän testin T/C-arvoihin ja havaitsimme, että suhdeluvut vaihtelivat 0,9:n ja 1,1:n välillä (Supplementary Dataset 1). Tämä osoittaa, että kaksisäikeisen RNA:n läsnäolo ei AU-pitoisuudesta riippumatta vaikuta merkittävästi HC-FIA-määrityksen suorituskykyyn.

HC-FIA-määrityksen herkkyys ja tarkkuus

Laimensimme sarjallisesti pseudovirusnäytteet, jotka sisälsivät kolme kohdegeenien jaksoa, tiittereihin 5 000, 2 500, 1 000, 800, 500, 250 ja 100 TU ml-1, ja laskimme keskimääräiset T/C-arvot 20 rinnakkaisesta testistä. Kuvasta 2a käy ilmi, että SARS-CoV-2:n N-, E- tai ORF1ab-alueen suhteen positiivisten pseudovirusten havaitsemisrajat (LOD-arvot) olivat niinkin alhaiset kuin 1 000 TU ml-1, ja positiivinen osuus oli yli 95 prosenttia. Kun pseudovirusnäytteiden titterit nousivat 108 TU ml-1:een, merkittävää koukkuvaikutusta ei havaittu (täydentävä kuva 2). Määrityksen lineaarinen alue vastaa tittereitä välillä 103-106 tai 107 TU ml-1.

Pystysuorilla akseleilla on esitetty testisignaalin (T) ja kontrollisignaalin (C) fluoresenssin intensiteettisuhde (T/C). Kunkin pitoisuuden osalta tehtiin 20 rinnakkaista testiä. LOD määritettiin pitoisuudeksi, jossa positiivinen osuus oli vähintään 95 %. a, SARS-CoV-2:n N-, E- ja ORF1ab-alueiden suhteen positiivisten sarjalaimennettujen pseudovirusnäytteiden T/C-suhteet. b, kolmen kriittisesti sairaan potilaan sarjalaimennettujen kurkunpyyhkäisynäytteiden T/C-suhteet. Tiedot ovat keskiarvoja ± s.d.

Kolmen kriittisesti sairaan potilaan kurkunpyyhkäisynäytteet – jotka todettiin positiivisiksi SARS-CoV-2:n suhteen RT-qPCR:n avulla ja viruskuormitus kvantifioitiin digitaalisella PCR:llä – sekoitettiin negatiivisiin kurkunpyyhkäisynäytteisiin sarjalaimennosten valmistamiseksi, joiden suuruudet olivat 2000, 1000, 500, 400 ja 250 kopiota millilitrassa. Kuten kuvasta 2b käy ilmi, LOD oli 500 kopiota millilitrassa, ja positiivinen osuus oli yli 95 prosenttia. LOD:n tarkistamiseksi käytettiin kliinisiä kurkunpyyhkäisynäytteitä, joiden T/C-arvot olivat lähellä positiivisuuden kriittistä arvoa (100) (näytteet, joissa oli 512, 489 ja 497 kopiota millilitrassa ORF1ab-alueella digitaalisen PCR:n mukaan) (testit tehtiin 20 kertaa rinnakkain). Näiden näytteiden positiivisuusprosentti oli yli 95 % (lisätaulukot 14-16).

HC-FIA-pakkauksen tarkkuuden arvioimiseksi rinnakkaistestit tehtiin 20 kertaa kullekin kliiniselle nielunäytteelle viiden peräkkäisen päivän aikana. Edustaviksi kliinisiksi näytteiksi valittiin positiivinen näyte (ORF1ab-alueen 1 348 kopiota millilitrassa), näyte kriittisesti sairaalta henkilöltä (kriittinen; 512 kopiota millilitrassa) ja negatiivinen näyte (0 kopiota millilitrassa). Kolmen erän keskimääräiset T/C-arvot positiivisen näytteen havaitsemisessa olivat seuraavat: 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13 %), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94 %) ja 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73 %), verrattuna 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65 %), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08 %) ja 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19 %) kriittisen näytteen osalta ja 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52 %), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18 %) ja 44,72 ± 2,98 (CV = 6,18 %) kriittisen näytteen osalta.66 %) negatiivisessa näytteessä. Eräkohtaiset CV-arvot olivat 3,89 %, 4,66 % ja 6,74 %. Näin ollen määritys osoitti hyvää tarkkuutta ja toistettavuutta SARS-CoV-2:n osoittamisessa.

HC-FIA-määrityksen kestävyys

HC-FIA:n kestävyyden selvittämiseksi arvioimme endogeenisten häiriöaineiden (kuten hemoglobiini ja mukiini) ja eksogeenisten häiriöaineiden (erityisesti kliiniset lääkkeet, joita käytetään yleisesti hengitystieinfektiopotilaiden hoidossa, mukaan lukien viruslääkkeet, antibiootit ja hormonit) vaikutuksia. Tässä kokeessa käytettiin 18 kliinistä kurkunpyyhkäisynäytettä, joista kuusi oli kriittisiä (digitaalisen PCR:n mukaan 500-530 kopiota millilitrassa ORF1ab-alueen osalta), kuusi negatiivista näytettä ja kuusi positiivista näytettä. Tulokset kirjattiin myös T/C-arvojen suhteena (häiriönäytteet suhteessa kontrollinäytteisiin). Valmistetuissa häiriönäytteissä hemoglobiinipitoisuudet olivat 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 ja 2,0 g l-1, ja mukiinipitoisuudet olivat 5 g l-1, 10 g l-1 ja 20 g l-1. Eksogeenisten häiriönäytteiden lääkeainepitoisuudet (lisätaulukot 17-19) olivat paljon korkeampia kuin niiden huippupitoisuudet plasmassa in vivo. Odotetusti kaikki T/C-suhteet olivat välillä 0,9-1,1 (Supplementary Dataset 2), mikä osoittaa, että HC-FIA-määritys on häiriönkestävä.

HC-FIA-testisarjan kliininen arviointi

HC-FIA-määrityksen suorituskyvyn arvioimiseksi tarkemmin suoritettiin satunnaistettu kliininen kaksoissokkotutkimus, jossa määritystä verrattiin RT-qPCR:ään (Shanghai ZJ Bio-Techin valmistama ja NMPA:n hyväksymä SARS-CoV-2-tunnistussarja) tai kliinisiin diagnoosituloksiin kolmessa riippumattomassa lääketieteellisessä laitoksessa. Kliinisessä arvioinnissa käytetty HC-FIA-testipakkaus sisälsi testikortit, lyysipuskurin, näytteen säilytysliuoksen, positiiviset ja negatiiviset kontrollit sekä reaktioputken, jossa oli DNA-koettimia ja leimattuja vasta-aineita. Nimettyjen sairaaloiden toimittamat vahvistettujen tai poissuljettujen COVID-19-tapausten kliiniset diagnoositulokset perustuivat tietokonetomografiakuviin ja potilaiden kliinisiin oireisiin Kiinan ohjeiden ”Diagnosis and Treatment Protocol for Novel Coronavirus Pneumonia (Trial Version 6.0)” mukaisesti. Yhteensä 734 näytettä (593 kurkunäytettä ja 141 ysköksenäytettä), jotka olivat peräisin 670 henkilöltä, testattiin rinnakkain. Kliinisten tutkimusten raakatiedot esitetään lisätietoaineistossa 3. Käyttämämme RT-qPCR-tunnistuspakkaus suunniteltiin kolmen kohteen (ORF, N ja E) järjestelmäksi, ja noudatimme positiivisten ja negatiivisten näytteiden erottamisessa test-retest-periaatetta. Neljän virheellisen sisäisen standardin aiheuttaman epäonnistuneen testin lisäksi tehtiin kahdeksan uusintatestiä: yksi, koska vain yksi rdrp-kohdegeeni oli positiivinen, ja seitsemän, koska vain N- ja E-geenit olivat positiivisia. Näissä tapauksissa aiemmat negatiiviset tulokset jätettiin pois.

Tutkimukseen osallistuneista 670 potilaasta 313 oli miehiä (46,72 %) ja 357 naisia (53,28 %). Kuten täydentävästä kuvasta 3 käy ilmi, ilmoittautuneen väestön ikäjakauma on samanlainen kuin SARS-CoV-2-infektion ikäjakauma21. Käyntimäärät ja diagnoosimäärät olivat myös tasapainossa. HC-FIA-testipakkausten tulokset on esitetty kuvassa 3, jossa on valokuvia tyypillisistä tuloksista fluoresoivassa valonlähteessä ja vastaava gradienttivärimatriisi lukeman normalisoinnin jälkeen. Lisäkuvassa 4 olevassa gradienttiväri-matriisissa näkyvät 734 kliinisen näytteen normalisoidut fluoresenssilukemat (Supplementary Dataset 3).

Kuvat tyypillisistä tuloksista fluoresoivan valonlähteen alla ja vastaavat fluoresenssilukemat värigradienttimatriisina, joka on normalisoitu maksimilukema-arvoon. Ryhmä E koostuu ainoastaan COVID-19-negatiivisista tuloksista. Väripalkin vaakasuora viiva osoittaa raja-arvon. Värigradienttimatriisi 734 kliinisen näytteen fluoresenssilukemille on esitetty täydentävässä kuvassa 4 ja vastaavat numeeriset tiedot täydentävässä tiedostossa 3.

621 tapauksen osalta HC-FIA-tulokset ja kliiniset diagnoosit vastasivat toisiaan (210 vahvistettua tapausta ja 411 poissuljettua tapausta; taulukko 1); 49 tapausta (27 vahvistettua ja 22 poissuljettua tapausta kliinisen diagnoosin perusteella) ei ollut yhteneväinen HC-FIA-tulosten kanssa. 730 näytteen osalta HC-FIA-testin tulokset vastasivat RT-qPCR:n tuloksia (249 positiivista ja 481 negatiivista; taulukko 1). Neljä näytettä, jotka olivat negatiivisia RT-qPCR:n perusteella, olivat positiivisia HC-FIA:n avulla. Näistä näytteistä kolme oli peräisin potilailta, joiden kliininen diagnoosi oli COVID-19:n poissulkeminen, mikä osoittaa, että HC-FIA-testi oli antanut vääriä positiivisia tuloksia. Jäljelle jäänyt näyte vastasi kliinisen diagnoosin perusteella vahvistettua tapausta, mikä oli sopusoinnussa HC-FIA-testin kanssa.

Cohenin Kappa (κ), jota käytetään usein kategoristen muuttujien välisen yhteisymmärryksen luotettavuuden mittarina, on kestävämpi mittari verrattuna pelkkään prosentuaaliseen yhteisymmärrykseen muuttujien välillä, koska κ:ssä otetaan huomioon sattumanvaraiset yhteisymmärrykset erityisesti epätasapainotetuissa aineistoissa. Katsoimme, että κ-arvo, joka on yli 0,75, osoittaa suurta yksimielisyyttä (täydellinen yksimielisyys vastaa κ = 1). Kuten taulukosta 2 käy ilmi, HC-FIA-testin tulokset olivat hyvin sopusoinnussa kliinisen diagnoosin (κ = 0,8393) ja RT-qPCR:n (κ > 0,98, näytetyypistä riippumatta) kanssa.