Abstract

Mycobacterium-suku aiheuttaa erilaisia zoonoottisia sairauksia. Tunnetuin esimerkki on M. bovis -bakteerin aiheuttama zoonoottinen tuberkuloosi. Paljon vähemmän tiedetään ”ei-tuberkuloottisista mykobakteereista (NTM)”, jotka liittyvät myös ihmisten infektioihin. Meksikon standardissa NOM-ZOO-031-1995 säännellään M. bovis -bakteerin esiintymistä naudoissa; NTM-lajeja koskevia säännöksiä ei kuitenkaan ole. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli eristää ja tunnistaa ei-tuberkuloottisia mykobakteerilajeja Meksikon osavaltion eteläisen alueen paikallisten karjojen nautaeläimistä tunnistamalla ja havaitsemalla 100 bp:n molekyylimarkkeri 23S rRNA -geenissä ja sen jälkeen sekvensoimalla 16S rRNA -geeni. Maitonäytteitä (35) ja nenäeritenäytteitä (68) kerättiin. Eristetyistä 108 kannasta 39 valittiin tunnistettavaksi. Kolmetoista nenän eritteistä eristettyä kantaa monistivat 100 bp:n molekyylimarkkerin, ja ne tunnistettiin M. neoaurumiksi (kuusi kantaa), M. parafortuitumiksi (neljä kantaa), M. moriokaenseiksi (kaksi kantaa) ja M. confluentisiksi (yksi kanta). M. parafortuitumia lukuun ottamatta muut tunnistetut lajit ovat kansanterveydellisiä ja eläinlääketieteellisiä huolenaiheita, koska ne ovat patogeenisiä ihmisille, erityisesti niille, joilla on perussairauksia.

1. Johdanto

Mykobakteerisuku aiheuttaa monenlaisia zoonoottisia sairauksia. Tunnetuin esimerkki on M. bovis -bakteerin aiheuttama zoonoottinen tuberkuloosi, jonka pääasiallinen reservuaari on karja. M. bovis on osa ”tuberkuloosikompleksia”, johon kuuluvat myös lajit M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae ja M. microti .

Mykobakteeriryhmään kuuluvat myös ”ei-tuberkuloottiset mykobakteerit (NTM)”, joihin liittyy myös infektioita ihmisillä. NTM:iä esiintyy erilaisissa ympäristölähteissä, kuten maaperässä, vedessä, kasvillisuudessa, eläimissä, maitotuotteissa ja ulosteissa, ja ne voivat tarttua tahattomasti hengittämällä, nielemällä tai ihoon tunkeutumalla .

Meksikolaisessa standardissa NOM-ZOO-031-1995 säännellään M. bovis -bakteerin esiintymistä nautaeläimissä nautojen tuberkuloosin (bTB) valvomiseksi ja hävittämiseksi; NTM-lajeista ei kuitenkaan ole olemassa mitään sääntelyä. M. bovis -bakteerin esiintymisestä johtuvan nautojen tuberkuloosin virallinen diagnoosi kenttätasolla perustuu ihonsisäiseen testiin, jossa käytetään puhdistettua proteiinijohdannaista (tuberkuliini). Vaikka tätä testiä on käytetty useita vuosia, sen herkkyys ja spesifisyys ei ole hyvä. Noin 20 prosenttia tuberkuloosia sairastavista eläimistä ei reagoi testiin , ja muiden mykobakteerilajien, sekä tuberkuloosikompleksin että NTM-lajien, esiintyminen aiheuttaa häiriöitä, jotka johtavat vääriin positiivisiin ja vääriin negatiivisiin diagnooseihin.

Vaikka Meksikossa on käytössä sääntelynormi, joillakin alueilla on raportoitu yli 2 prosentin bTB-esiintyvyyttä . Koska tuberkuliinitestin spesifisyys ja herkkyys ovat heikot, M. bovis -bakteerin todellinen esiintyminen on todennäköisesti vähäisempää ja muiden mykobakteerien aiheuttamien tartuntojen määrä naudoissa todennäköisesti suurempi. Näin ollen karjankasvattajat, eläinlääkärit, teknikot ja karjankasvatusalalla työskentelevät työntekijät saattavat ammatillisesti altistua M. bovis- ja NTM-tartunnoille. Työperäisestä altistumisesta NTM-lajien aiheuttamille zoonooseille tiedetään hyvin vähän, koska näiden lajien tunnistaminen oli melko vaikea tehtävä ennen molekyylibiologiaan perustuvien tunnistustekniikoiden kehittämistä.

Nykyaikana molekyylibiologisia tekniikoita, joita käytetään yleisimmin mykobakteerien aiheuttamien tautien diagnosointiin, ovat restriktiofragmenttipituuspolymorfismi (restriction fragment length polymorphism (RFLP)), jonka avulla voidaan diagnosoida M.bovisin ja M.bovisin aiheuttamia tauteja. tuberkuloosin diagnosoimiseksi, spoligotyypitys M. bovis -bakteerin diagnosoimiseksi ja Gram-positiivisille bakteereille ominaisen 100 emäsparin (bp) ”spesifisen insertion” havaitseminen 23S rRNA-geenissä, jolla on korkea guaniinisytosiinipitoisuus (HGC) ja jota pidetään tämän bakteeriryhmän molekyylimarkkerina , minkä jälkeen tehdään 16S rRNA-geenin sekvenssianalyysi bakteerien tunnistamiseksi lajitasolla.

Edellä mainituilla tekniikoilla tunnistettuihin NTM-lajeihin kuuluvat M. balnei, M. marinum ja M. platypoecilus, jotka ovat aiheuttaneet pinnallisia ja syviä ihovaurioita ; M. kansasii keuhkovaurioista ; M. simiae yleisinfektioista ; M. scrofulaceum ihon ja sisäelinten infektioista ; M. szulgai keuhkoinfektioista, osteomyeliitistä, tenosynoviitista ja lymfadeniitista ; M. ulcerans ihonalaisista granuloomista ; M. fortuitum ja M. chelonae, jotka liittyvät vaskuliittiin, endokardiittiin, osteomyeliittiin, mediastiniittiin, aivokalvontulehdukseen, keratiittiin ja hepatiittiin ; M. abscessus, joka liittyy erytematoottisiin leesioihin, jotka etenevät ulseroiviksi kyhmyiksi ; ja muut lajit.

Meksikon osavaltion nautakarjan valtionvarastosta suurin osa Meksikon osavaltio Meksikon osavaltiossa on keskittynyt eteläiselle alueelle, ja yksi tärkeimmistä taloudellisista elinkeinoista on karjankasvatus . Meksikon nautaeläinten valvontaa koskevassa asetuksessa NOM-ZOO-031-1995 keskitytään ainoastaan tuberkuliinitestiin M. bovis -bakteerin diagnosoimiseksi. NTM:n esiintymisestä alueen karjassa tiedetään vain vähän. Koska aktinobakteerilajeja on mahdollista tunnistaa 23S rRNA -geenin 100 emäsparin molekyylimarkkerin havaitsemisella ja sitä seuraavalla 16S rRNA -geenin sekvensoinnilla, on mahdollista tunnistaa edellä mainitut NTM-lajeja.

Tässä tutkimuksessa pyrittiin eristämään ja tunnistamaan NTM-lajeja Meksikon osavaltion eteläisen alueen naudoista. Mycobacterium-lajit eristettiin nenän eritteestä ja naudanmaidosta otetuista näytteistä, ja ne tunnistettiin havaitsemalla 23S rRNA -geenin 100 emäsparin molekyylimarkkeri ja sen jälkeen sekvensoimalla 16S rRNA -geeni.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Aineisto ja menetelmät

. Näytteenotto

Näytteenotto suoritettiin Zaragozan ym. 2015 suorittaman naudan tuberkuloosille positiivisten karjojen alueellisen jakautumisen perusteella Meksikon osavaltiossa . Meksikon osavaltion eteläisellä alueella valittiin neljä nautakarjaa, joista yksi kuului Temascaltepecin kuntaan ja kolme Zacazonapanin kuntaan. Näytteitä kerättiin yhteensä 103 kappaletta, 35 maitonäytettä ja 68 näytettä nenäeritteestä. Taulukossa 1 esitetään kussakin karjassa kerättyjen näytteiden määrän ja tyypin jakautuminen.

.

.

Ominaisuus Karja 1 Karja 2 Karja 3 Karja 4 Yhteensä
Kunta Temascaltepec Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan
Rotu F1 sveitsiläinen-Cebu Holstein friisiläinen Holstein friisiläinen Holstein friisiläinen
Geografinen sijainti La-19°03′13.7′′Lo-100°13′36.7′′ La-19°03′39.5′′Lo-100°16′30.9′′ La-19°04′0.4′′Lo-100°15′11.5′′ La-19°03′41′′Lo-100°16′06′′′
BTB:n historia Prevalenssi Prevalenssi Prevalenssi Prevalenssi Prevalenssi
Saadut näytteet
Maito 15 20 0 0 35
Nenäerite 0 18 23 27 68
103
La: leveysaste; Lo: pituusaste; bTB: naudan tuberkuloosi. saatu Meksikon osavaltion karjankasvatuksen edistämis- ja suojelukomitealta.
Taulukko 1
Meksikon osavaltion eteläisen alueen nautakarjoista kerätyt näytteet.

2.2. Meksikon osavaltion eteläisen alueen nautakarjoista kerätyt näytteet. Maito- ja nenäeritenäytteiden ottaminen

Utare ja nännit puhdistettiin puhdistetulla vedellä ja saippualla, minkä jälkeen ne kuivattiin paperipyyhkeillä, minkä jälkeen nännien aseptiikka suoritettiin 70-prosenttiseen alkoholiin kastetuilla pyyhkeillä. Viisi millilitraa maitoa kerättiin suoraan nännistä steriileihin 20 ml:n astioihin, ja alkuvirtaus hylättiin. Nenäerite kerättiin suoraan nenän suuaukon sisäpuolelta 10 cm:n pituisella steriilillä pyyhkeellä, joka upotettiin isotoniseen suolaliuokseen (0,85 %). Maito- ja nenäeritenäytteet säilytettiin 4 °C:ssa käsittelyyn asti.

2.3. Näytteiden käsittely
2.3.1. Mykobakteerien eristäminen

Maitonäytteet sentrifugoitiin 2500 kierrosta minuutissa (rpm) 10 minuutin ajan. Maito- ja nenäeritenäytteiden pelletit inokuloitiin seuraavaan mykobakteereille selektiiviseen elatusaineeseen: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) ja Middlebrook (BD BBL 254521), täydennettynä 6 g:lla natriumpyruvaattia litrassa (Middlebrook-P). Inokuloituja väliaineita inkuboitiin 37 °C:ssa 8 viikon ajan ja ne arvioitiin 3 päivän välein.

2.3.2. Eristettyjen kantojen luokittelu

Eristetyt kannat jaettiin ryhmiin seuraavien ominaisuuksien mukaan: pesäkkeiden pigmentaatio, kasvuaika ja pesäkkeiden ominaisuudet (muoto, koostumus, rakenne ja pigmenttituotanto). Eristetyt kannat värjättiin Ziehl-Neelsen-värjäyksellä happobakteerien (AFB) esiintymisen varmistamiseksi .

2.4. DNA:n uuttaminen

Kannat, joiden mikroskooppiset ominaisuudet muistuttivat mykobakteereja (happofast-positiivisuus), ja kaksi edustavaa kantaa kustakin ryhmästä valittiin tunnistusta varten. Biomassan saamiseksi kannat inokuloitiin 30 ml:aan Middlebrookin nestemäistä elatusainetta (BD BBL 254521) 125 ml:n pulloihin ja inkuboitiin 37 °C:ssa 7 päivän ajan. Nestemäinen elatusaine siirrettiin steriileihin 15 ml:n Falcon-putkiin ja sentrifugoitiin 15 minuuttia 14 000 rpm:ssä. Sitten supernatantti poistettiin ja pelletti siirrettiin 1,5 ml:n Eppendorf-putkiin; putkia sentrifugoitiin sitten 14 000 rpm × 5 minuuttia ja supernatantti hävitettiin. DNA:n uutto suoritettiin saadusta pelletistä käyttäen Wizard Genomic DNA Purification Kit -pakettia (Promega A1120).

2.5. 23S rRNA-geenin molekyylimarkkerin osoittaminen

23S rRNA-geenissä sijaitseva 100 bp:n molekyylimarkkeri monistettiin Rollerin ym. kuvaaman menetelmän mukaisesti. (1992) mukaan käyttäen seuraavia alukkeita : 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, ja 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

Reaktio suoritettiin kaupallisella Taq DNA-polymeraasilla (Promega M1661). Käytettiin seuraavia lämpösykliolosuhteita: esi-denaturaatiovaihe 5 minuuttia (94 °C); 29 sykliä, joissa denaturoitiin 30 sekuntia (94 °C), hybridisoitiin 45 sekuntia (46 °C) ja elongoitiin 50 sekuntia (72 °C); ja lopuksi postelongaatiosykli 5 minuuttia (72 °C). Monistetut fragmentit vahvistettiin 2-prosenttisella agaroosigeelillä, joka värjättiin etidiumbromidilla (SIGMA 46065).

2.6. 16S rRNA-geenin monistaminen

Kannat, jotka monistivat 100 bp:n fylogeneettisen merkkiaineen, valittiin 16S rRNA:n sekvensointianalyysiä varten. Monistuksessa käytettiin seuraavia alukkeita: 8f: AGAGTTTTGATCMTGGCTCAG ja 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGGACTT.

Reaktiossa käytettiin kaupallista Taq DNA-polymeraasia (Promega M1661). Käytettiin seuraavia lämpösykliolosuhteita: yksi esi-denaturaatiovaihe 5 minuutin ajan (94 °C); 34 sykliä, joissa denaturaatio 30 sekuntia (94 °C), hybridisaatio 20 sekuntia (52 °C) ja elongaatio 1 minuutti 30 sekuntia (72 °C); ja lopuksi 7 minuutin postelongaatiosykli (72 °C).

Vahvistetut fragmentit vahvistettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä, joka värjättiin etidiumbromidilla (SIGMA 46065). Tämän monistuksen tuotteet puhdistettiin Amicon Ultra Filter® -kitillä (Millipore UFC901008) ja vahvistettiin 1 % agaroosigeelillä niiden läsnäolon ja laadun varmistamiseksi.

2.7. Tuotteet puhdistettiin. Mykobakteerilajien tunnistaminen

16S rRNA -geenin monistetut tuotteet lähetettiin Macrogen Sequencing Service -palveluun, Maryland, Yhdysvallat. Saadut sekvenssit analysoitiin ja korjattiin BioEdit-ohjelmalla . Eteenpäin ja taaksepäin menevistä fragmenteista muodostettiin konsensussekvenssit, joita verrattiin aiemmin National Center for Biotechnology Informationin (NCBI) GenBank-tietokantaan talletettuihin sekvensseihin BLAST-ohjelman ja EzTaxon 2.1 .

2.8 avulla. Fylogeneettinen analyysi

16S rRNA -geenin sekvenssit saatiin seuraavista mykobakteerilajeista American Type Culture Collectionista (ATCC) ja German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense ja M. confluentis . Kokoelmakantojen ja tässä tutkimuksessa eristettyjen kantojen sekvenssit sovitettiin yhteen BioEdit-ohjelmalla . Fylogeneettinen analyysi suoritettiin käyttämällä maksimaalisen parsimonian menetelmää MEGA-ohjelmiston versiossa 4 . Kladogrammin juuren muodostamiseksi käytettiin Pantoea agglomerans DSM 3493:n sekvenssiä.

3. Tulokset

Kerätyistä 103 näytteestä eristetyt 108 kantaa jaettiin 13 ryhmään makroskooppisten ja mikroskooppisten morfologisten ominaisuuksiensa mukaan (taulukko 2). Erityisesti ryhmät 11 ja 12 koostuivat haponkestävistä kannoista.

Ryhmä Kantojen lukumäärä Morfologiset ominaisuudet Molekyylinen merkkiaine (bp)
Makroskooppinen Mikroskooppinen 23S rRNA
Pigmentaatio Esimerkkejä Esimerkkejä Ziehl-Neelsen
1 29 Keltainen Creamy – 250
2 10 Valkoinen Kreamankeltainen – 250
3 14 Valkoinen Kuiva – 250
4 2 Lohi Kuiva – 250
5 2 Lohi Kuiva – 250
6 2 Valk, tumma kermanvärinen – 250
7 2 White Creamy – 250
8 3 White, tumma kuiva – 250
9 4 valkoinen Kuiva – 250
10 10 Valkoinen Creamy, kuiva – 250
11 10 valkoinen Kuiva + 350 ja 250
12 7 Keltainen Creamy + 350
13 13 White Kuiva – 250
-: haponkestävien bakteerien puuttuminen; +: haponkestävien bakteerien esiintyminen; Bp: emäsparit.
Taulukko 2
Isoloidut kannat on ryhmitelty morfologisten ominaisuuksien ja 23S rRNA-geenin molekyylimarkkerin (100 bp) esiintymisen perusteella.

Lajin tasolla tapahtuvaa tunnistusta varten valittiin 39 kantaa: niistä 10 kuului ryhmään 11 ja 7 ryhmään 12. Ryhmään 11 kuului 10 ja 7 ryhmään 12. Kustakin jäljelle jääneestä 11 ryhmästä valittiin kaksi kantaa, jotta 39 kantaa saatiin täydennettyä. 100 bp:n molekyylimarkkeri löytyi 33 prosentista (13/39) valituista kannoista. Niistä monistettiin 16S rRNA -geeni sekvensointia ja lajitason tunnistamista varten.

NTM:n kokonaisprevalenssi kerätyissä näytteissä oli 12,6 % (13/103), kun otetaan huomioon sekä maito- että nenäneritenäytteet. Spesifinen esiintyvyys nenän eksudaattinäytteissä oli kuitenkin 19,1 % (13/68).

Sekvenssivertailun perusteella tunnistettiin neljä Mycobacterium-sukuun kuuluvaa NTM-lajia; 64 %:lla (6/13) kannoista oli 98 %:n ja 99 %:n yhtäläisyydet M. neoaurum, kun taas 31 %:lla (4/13) oli 99 %:n samankaltaisuus M. parafortuitum -bakteerin kanssa, 15 %:lla (2/13) oli 98 %:n ja 99 %:n samankaltaisuus M. moriokaense -bakteerin kanssa ja lopuksi 8 %:lla (1/13) oli 99 %:n samankaltaisuus M. confluentis -bakteerin kanssa (taulukko 3).

Kanta Kannan alkuperä Viljelyalusta Viljelyalusta Valmistettu. fragmentin koko (bp) Similariteetti (Blast) % Similariteetti (EzTaxon) %
1-AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3
2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1
3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2
5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.2
8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0
12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4
4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9
10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4
11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2
13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2
7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1
2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.
Taulukko 3
Karjasta eristettyjen kantojen 16S rRNA -geenisekvenssien vertailu GenBankissa dokumentoituihin kantoihin BLASTin ja EzTaxonin avulla.

Mycobacterium-suvun ja neljän sen lajin avulla muodostettiin fylogeneettinen puu, jonka avulla havaittiin keräyskantojen ja tässä tutkimuksessa eristettyjen kantojen väliset fylogeneettiset suhteet (kuva 1).

Kuva 1
Fylogeneettinen puu, joka muodostettiin vertailemalla eristettyjen kantojen ja referenssikantojen 16S rRNA -geenisekvenssejä.

4. Pohdinta

NTM-lajeja eristettiin vain nenän eritteestä otetuista näytteistä, mikä sulki pois tämän tutkimuksen yhdestä paikallisesta tilasta otetut näytteet (taulukko 1). Havaitsimme, että spesifinen esiintyvyys oli 19,1 % Meksikon osavaltion eteläisen alueen karjoissa. Yhdysvalloissa, Etelä-Afrikassa, Tansaniassa ja Brasiliassa tehdyissä vastaavissa tutkimuksissa NTM:n esiintyvyys oli 3,4 %, 24,5 %, 7 % ja 7,8 %, joten tässä tutkimuksessa todettu esiintyvyys on aiemmin ilmoitettujen arvojen sisällä. Tässä tutkimuksessa 39 analysoidusta kannasta 13 tunnistettiin NTM-lajeiksi M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis ja M. parafortuitum.

M. neoaurum, Mycobacterium parafortuitum -kompleksin jäsen, on vastuussa monenlaisista sairauksista, joista suurin osa on laitteisiin liittyviä infektioita, kuten Hickman-katetrit, BROVIAC-katetrit, PICC-linjat , arteriovenoosinen fisteli, johon kuului polytetrafluorieteenigraftti , tahdistimet ja proteesiläppäendokardiitti . Immuunipuutteiset potilaat, joilla on näitä laitteita, ovat pääasiallisia isäntiä, esimerkiksi syöpäpotilaat ja diabeetikot, joilla on munuaisten vajaatoiminta ja sydänongelmia . M. neoaurumia on eristetty myös potilailta, joilla on virtsainfektioita , meningoenkefaliittia ja keskushermoston muutoksia , bakteremiaa ja endokardiittia sekä keuhkoinfektioita . Vaikka se on eristetty pääasiassa kliinisistä tapauksista, sen eristämisestä maidosta ja karjasta on myös raportteja .

M. moriokaense on eristetty ysköksenäytteestä . Vaikka sitä pidetään ihmiselle ei-patogeenisena, se on yhdistetty keuhkosairauksiin . M. confluentis eristettiin myös ysköksenäytteistä , ja yhdessä M. parafortuitumin kanssa molempia pidetään ei-patogeenisinä lajeina. M. confluentis, M. moriokaense ja M. neoaurum on eristetty erilaisista nautaeläinten ja luonnonvaraisten eläinten kudoksista, joissa on tuberkuloottisia vaurioita, kun taas M. parafortuitum on eristetty ainoastaan naudanmaidosta . Työssämme M. parafortuitum eristettiin kuitenkin vain nenän eritenäytteistä.

Mykobakteerien ravitsemukselliset vaatimukset vaihtelevat eri lajien välillä, mikä oli syynä erilaisten elatusalustojen käyttöön. Huomattavaa on, että tässä tutkimuksessa tunnistetuista 13 kannasta seitsemän eristettiin Stonebrink-mediasta, mukaan lukien M. neoaurum, M. parafortuitum ja M. moriokaense. Tämä tulos on yhdenmukainen Sepúlvedan ym. kuvaaman tuloksen kanssa, jonka mukaan Stonebrink-alusta soveltuu Mycobacterium-suvun eri lajien talteenottoon. García-Martos ja García-Agudo ilmoittivat, että Middlebrook-alusta on optimaalinen aktinomykeettien eristämiseen, mikä on sopusoinnussa tämän tutkimuksen kanssa, kun otetaan huomioon, että kaksi lajia, M. neoaurum ja M. parafortuitum, eristettiin tästä alustasta. Erityisesti M. confluentis eristettiin ainoastaan Middlebrook-mediasta, jota oli täydennetty natriumpyruvaatilla; näin ollen strategia, jossa käytettiin eri elatusalustoja, oli tarkoituksenmukainen, koska se mahdollisti Mycobacterium-suvun eri lajien eristämisen.

Gram-positiivisten bakteerien 23S rRNA-geenissä esiintyvän molekyylimarkkerin havaitseminen HGC-pitoisuuksiltaan mahdollisti erottelun eubakteeri- ja mykobakteerikantojen välillä. 16S rRNA -geenin sekvensointianalyysi mahdollisti tunnistamisen lajitasolla; siksi näiden menetelmien yhdistelmä soveltuu NTM-lajien tunnistamiseen.

5. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa kuvatulla menetelmällä eristettiin ja tunnistettiin neljä NTM-lajia: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum ja M. parafortuitum. Nämä lajit eristettiin ensimmäistä kertaa Meksikon osavaltion eteläiseltä alueelta peräisin olevien nautojen nenäeritteistä. Kolme tunnistetuista lajeista (M. neoaurum, M. moriokaense ja M. confluentis) on kansanterveydellisesti ja eläinlääketieteellisesti merkittäviä.

Tiedonanto

Tämä työ on peräisin PNPC-CONACYT-järjestelmään rekisteröidystä terveystieteiden tohtorin tutkintoa varten tehdystä väitöskirjatyöstä (Universidad Autónoma del Estado de México).

Interressiristiriidat

Kaikki kirjoittajat ilmoittavat, ettei heillä ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tekijät haluaisivat kiittää Universidad Autónoma del Estado de Méxicon tutkimus- ja jatko-opintosihteeristöltä (UAEMex) saamastaan taloudellisesta tuesta seuraavien tutkimusapurahojen kautta: (i) ”Implementation of Geographic Information Systems and Techniques of Molecular Biology, as tools in detection and identification of Mycobacterium spp.” (Paikkatietojärjestelmien ja molekyylibiologian tekniikoiden käyttöönotto välineinä Mycobacterium spp. havaitsemisessa ja tunnistamisessa), SIEA-UAEM 3486/2013CHT, ja (ii) verkosto ”Microbiología y química en las Ciencias de la Salud” (Mikrobiologia ja kvimika terveydenhuollon tieteenaloilla), 039/2014RIF.

.