Sopivien restriktioentsyymien valinta määriteltyjen kriteereiden perusteella
Yhteenvetoisessa esimerkissä tdTomato-fluoresenssivärinen valkuaisproteiini kloonattiin alfareetroviraaliseen vektoriin. Tämän jälkeen luotiin tdTomatoa ilmentävä hiiren leukemiasolulinja. Tätä solulinjaa tullaan käyttämään kasvainsolujen seuraamiseen injektion jälkeen hiiriin prekliinisissä immunoterapiatutkimuksissa. Tätä kloonausmenetelmää voidaan kuitenkin soveltaa mihin tahansa muuhun geeniin. Kloonausprojektin aloittamiseksi on analysoitava kiinnostava geeni. Ensin tarkistetaan, onko annotoidussa sekvenssissä aloituskodoni (ATG, yleisin aloituskodoni) ja yksi kolmesta lopetuskodonista (TAA, TAG, TGA). Jos geeniä on aiemmin manipuloitu tai fuusioitu toiseen geeniin (esim. 2A-sekvenssin kautta), voi käydä niin, että kiinnostavalla geenillä ei ole stop-kodonia. Tällaisissa tapauksissa stop-kodoni on lisättävä annotoidun sekvenssin loppuun. On myös hyödyllistä tutkia, sisältääkö GOI:si avoimen lukukehyksen (ORF). Tämä on tärkeää, koska usein tapahtuva sekvenssien manipulointi joko ohjelmallisesti tai kloonaamalla saattaa lisätä tai poistaa virheellisesti nukleotideja. Käytämme Clone Manager -ohjelmistoa (SciEd) etsiessämme ORF:iä plasmidisekvensseistämme; on kuitenkin olemassa useita ilmaisia verkkosivustoja, joita voit käyttää ORF:ien etsimiseen, mukaan lukien NCBI:n avoimen lukukehyksen etsijä (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html).
TdTomato-geenissä on ATG-käynnistyskoodoni ja TAA-stoppikoodoni (kuva 1). TdTomato-geenin koko on 716 bp.
Yleiskatsaus kiinnostavan geenin alkuun ja loppuun. (A) Nukleotidisekvenssit tdTomato-geenin alussa ja lopussa on esitetty. Koodaavan säikeen nukleotidit on merkitty lihavoituna (B) Oikeat restriktioentsyymikohdat sisältävien etu- ja käänteisalukkeiden nukleotidisekvenssit ja Kozak-sekvenssi on esitetty.
Seuraavassa vaiheessa on suunniteltava oikeat restriktioentsyymikohdat sisältävät PCR-alkuaineet GOI:n monistamista varten. Optimaalisten restriktioentsyymien valinnassa olisi otettava huomioon useita kriteerejä. Ensinnäkin restriktioentsyymien sitoutumiskohtien olisi mieluiten oltava saatavilla vektorin moninkertaisessa kloonauspaikassa. Vaihtoehtoisesti ne voivat sijaita promoottorin alapuolella vektorisekvenssissä. Restriktioentsyymien olisi oltava single cuttereita (single cutterit kohdistuvat vain yhteen restriktiokohtaan DNA-sekvenssissä) (kuva 2A). Jos ne ovat kaksois- tai monileikkureita, niiden pitäisi leikata sekvenssiä, joka ei ole välttämätön vektoriplasmidin moitteettoman toiminnan kannalta, ja ne poistetaan lopulta (kuva 2B). On myös mahdollista valita yksi kaksoisleikkuri tai monileikkurientsyymi, joka leikkaa vektorin promoottorin alapuolelta eikä myöskään plasmidin elintärkeän sekvenssin sisältä (kuva 2C). Kaksoisleikkuri- tai monileikkurientsyymeillä on kaksi tai useampia restriktiokohtia DNA-sekvenssissä. Vektorin leikkaaminen kaksois- tai monileikkurilla tuottaisi kaksi identtistä päätä. Tällöin myös inserttikasetin pitäisi sisältää samat restriktioentsyymikohdat molemmissa päissään. Kun insertin ja vektorin fragmentit sekoitetaan ligointikokeessa, insertti voi sulautua vektoriin joko oikeassa orientaatiossa (aloituskodonista pysäytyskodoniin) tai käänteisesti (pysäytyskodonista aloituskodoniin). Kolmas skenaario voi toteutua, jos vektorifragmentti muodostaa itsestään ligoituvan ympyrän, josta insertti puuttuu kokonaan. Kun DNA:ta on inkuboitu restriktioentsyymien kanssa, vektoriplasmidin 5′- ja 3′-päiden defosforylointi emäksisen fosfataasientsyymin avulla vähentää huomattavasti itseligatoinnin riskiä. Siksi on tärkeää seuloa kloonaustuote näiden kolmen tuotteen (oikea orientaatio, käänteinen orientaatio, itseligaatio) varalta fragmentin ligoimisen jälkeen.
Sopivien restriktioentsyymien valinta määriteltyjen kriteerien perusteella PCR-kloonaukseen. (A) Kaksi yhden leikkurin restriktioentsyymiä (E1 ja E2) sijaitsevat promoottorin alapuolella. (B) E1- ja E2- restriktioentsyymit leikkaavat plasmidia promoottorin alapuolella useita kertoja (tässä kaksi kertaa kummallekin entsyymille). (C) E1-restriktioentsyymi leikkaa plasmidia promoottorin alapuolella useammin kuin kerran. (D) PCR-tuote, joka sisältää tdTomato-geenin ja restriktioentsyymikohdat, ajettiin geelillä ennen kuin se uutettiin downstream-sovelluksia varten.
Toiseksi, koska kloonauksen tehokkuus on suurempi, kun käytetään sticky-end-DNA-fragmentteja, on toivottavaa, että ainakin toinen (tai mieluummin kumpikin) restriktioentsyymeistä on niin sanottu sticky-end-clutter. Sticky end -leikkurit pilkkovat DNA:ta epäsymmetrisesti tuottaen komplementaarisia koheesiopäätteitä. Sitä vastoin tylpän pään leikkurit leikkaavat sekvenssin symmetrisesti jättäen yliviivoja. Tylppäpäätteisten fragmenttien kloonaaminen on vaikeampaa. Suuremmalla insertin ja vektorin moolisuhteella (5 tai enemmän) ja käyttämällä 10 % polyetyleeniglykolia (PEG) voidaan kuitenkin parantaa tylpän pään fragmenttien ligointia.
Kolmanneksi, jotkin restriktioentsyymit eivät leikkaa metyloitunutta DNA:ta. Useimmat E. coli -kannat sisältävät Dam- tai Dcm-metylaaseja, jotka metyloivat DNA-sekvenssejä. Tämä tekee niistä resistenttejä metylaatioherkille restriktioentsyymeille. Koska vektori-DNA valmistetaan useimmiten E. colissa, se on metyloitunut. Siksi metylaatioherkkien restriktioentsyymien välttäminen on suotavaa; joskus metylaatioherkän restriktioentsyymin isositsomeeri on kuitenkin metylaatioresistentti. Esimerkiksi Acc65I-entsyymi on herkkä, kun taas sen isositsomeeri kpnI on metylaatioresistentti. Isositsomeerit ovat restriktioentsyymejä, jotka tunnistavat samoja nukleotidisekvenssejä. Jos ei ole muuta vaihtoehtoa kuin käyttää metylaatioherkkiä restriktioentsyymejä, vektorin DNA on valmistettava dam – dcm – E. coli -kannoissa. Taulukossa 1 on luettelo näistä kannoista sekä molekyylikloonauksessa käytettävistä yleisistä E. coli -isäntäkannoista. Tiedot restriktioentsyymien metylaatioherkkyydestä saa yleensä valmistajalta.
Neljänneksi kloonausta helpottaa, jos restriktioentsyymien täyteen toimintakykyyn tarvittava puskurikokoelma on sama, koska silloin voidaan suorittaa kaksinkertainen restriktiosulatus. Tämä säästää aikaa ja vähentää DNA:n hävikkiä puhdistuksen aikana. Saattaa käydä niin, että yksi restriktioentsyymeistä on aktiivinen yhdessä puskurissa ja toinen entsyymi on aktiivinen kaksinkertaisessa pitoisuudessa samaa puskuria. Esimerkiksi Thermo Scientificin NheI-entsyymi on aktiivinen Tango 1X -puskurissa (Thermo Scientific) ja EcoR1-entsyymi on aktiivinen Tango 2X -puskurissa (Thermo Scientific). Tällaisissa tapauksissa plasmidi-DNA on ensin pilkottava entsyymillä, joka vaatii suuremman puskurikonsentraation (tässä tapauksessa EcoR1). Tämän jälkeen laimennetaan puskuria seuraavaa entsyymiä (joka vaatii pienemmän pitoisuuden (tässä NheI)) varten samaan puskuriin. Yleispuskureiden käyttöönotto on kuitenkin yksinkertaistanut DNA-sekvenssien kaksinkertaista pilkkomista. Esimerkissämme vektori sisältää AgeI- ja SalI-restriktiokohdat. Näitä entsyymikohtia käytettiin PCR-alukkeiden suunnittelussa (kuva 1). Rajoitusentsyymien asianmukaisen digestion kannalta on olennaista, että plasmidin puhtaus on korkea. Puhtauden määrittämiseen puhdistuksen jälkeen voidaan käyttää spektrofotometrillä mitattua DNA:n absorbanssia. DNA, proteiinit ja liuottimet absorboituvat vastaavasti 260 nm:ssä, 280 nm:ssä ja 230 nm:ssä. OD 260/280 -suhdetta >1,8 ja OD 260/230 -suhdetta 2-2,2 pidetään DNA-näytteiden osalta puhtaana. Esimerkkiplasmidivalmisteidemme OD 260/280- ja 260/230-suhteet olivat vastaavasti 1,89 ja 2,22. Havaitsimme, että geelillä uutettujen vektori- ja insertti-DNA-fragmenttien puhtaus oli alhaisempi restriktiomädätyksen jälkeen; ligaatio toimii tällaisissakin tapauksissa, mutta parempia tuloksia voidaan kuitenkin odottaa käyttämällä erittäin puhtaita fragmentteja.
Seuraava plasmidivaraston verkkosivusto voi olla hyödyllinen erilaisten vektoreiden valinnassa (virusekspressio ja pakkaus, tyhjät selkärangat, fluoresoivat proteiinit, indusoitavat vektorit, epitooppitunnisteet, fuusioproteiinit, reportterigeenit, lajispesifiset ekspressiojärjestelmät, valintamarkkerit, promoottorit, shRNA-ekspressio ja genomitekniikka):http://www.addgene.org/browse/.
Kokoelma E. colin kloonausvektoreita on saatavilla seuraavalla verkkosivustolla:http://www.shigen.nig.ac.jp/ecoli/strain/cvector/cvectorExplanation.jsp.
Kloonausalukkeiden suunnittelu määriteltyjen kriteerien perusteella
PCR-alukkeiden suunnittelua varten tarkista GOI:n aloitus- ja lopetuskoodonit. Etsi haluttujen restriktioentsyymien sekvenssi (saatavilla valmistajien verkkosivuilta) eteenpäin suuntautuvaa aluketta varten (kuva 3A). Sen on sijaittava ennen GOI:tä (kuva 1B). Niin sanottu Kozak-sekvenssi esiintyy eukaryoottisissa mRNA:issa ja parantaa translaation käynnistymistä. Kozak-sekvenssin (GCCACC) lisääminen ennen ATG-starttikodonia on hyödyllistä, koska se lisää translaatiota ja kiinnostavan proteiinin ilmentymistä eukaryooteissa. Tämän vuoksi lisäsimme GCCACC-sekvenssin välittömästi restriktioentsyymisekvenssin AgeI jälkeen ja ennen ATG-starttikodonia. Tämän jälkeen etummaiseen alukesekvenssiin lisätään GOI:n ensimmäiset 18-30 nukleotidia ATG-starttikodonista alkaen. Nämä päällekkäiset nukleotidit, jotka sitoutuvat templaatti-DNA:han, määräävät annealing-lämpötilan (Tm). Viimeksi mainittu on yleensä yli 60 °C. Tässä käytetään Phusion high-fidelity DNA-polymeraasia (Thermo Scientific). Optimaalisen Tm:n määrittämiseen voi käyttää seuraavia verkkosivuja:http://www.thermoscientificbio.com/webtools/tmc/.
Alukkeiden suunnittelu määriteltyjen kriteerien perusteella PCR-kloonausta varten. (A-B) Eteenpäin ja taaksepäin suuntautuvan alukkeen sekvenssit on kuvattu. Koodaavan säikeen pää on muunnettava käänteiskomplementtimuotoon käänteisprimerien suunnittelua varten. Lisätietoja on tekstissä.
https://www.neb.com/tools-and-resources/interactive-tools/tm-calculator.
Eteenpäin suuntautuvan alukkeen Tm on 66 °C.
Valitse käänteisen alukkeen suunnittelua varten viimeiset 18-30 nukleotidia, mukaan luettuna suuntaa-antavan alkuperäisen proteiinisi lopetuskoodoni (kuva 3B). Laske sitten tämän sekvenssin Tm, jonka pitäisi olla yli 60 °C ja lähellä eteenpäin suuntautuvan alukkeen Tm:ää. Käänteisen alukkeen päällekkäisen sekvenssin Tm oli 68 °C. Lisätään sitten toisen restriktioentsyymikohdan (tässä tapauksessa SalI) kohdesekvenssi välittömästi stop-kodonin jälkeen. Muunnetaan lopuksi tämä koottu sekvenssi käänteiskomplementtisekvenssiksi. Seuraavia verkkosivuja voidaan käyttää käänteisen alukkeen sekvenssin määrittämiseen:
http://reverse-complement.com/
http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.htmlThis on tärkeää, koska käänteinen aluke sitoutuu koodaavaan säikeeseen ja siksi sen sekvenssin (5′ → 3′) on oltava käänteisesti komplementaarinen koodaavan säikeen sekvenssiin nähden (kuva 1A).
PCR:n suorittaminen oikolukupolymeraaseja käyttäen
Sen vuoksi, että PCR-reaktiossa noudatetaan kohdesekvenssin logaritmista monistumista, kaikki tämän prosessin aikana tapahtuvat monistumisvirheet monistuvat. Ei-korjaavien DNA-polymeraasien, kuten Taq-polymeraasin, virhetaso on noin 8 × 10-6 virhettä/bp/PCR-sykli, mutta korjaavien entsyymien, kuten Phusion-polymeraasin, virhetaso on ilmoitettu olevan 4,4 × 10-7 virhettä/bp/PCR-sykli. Tässä esimerkissä käytettiin Phusion DNA-polymeraasia sen paremman uskollisuuden ja prosessointikyvyn vuoksi. On huomattava, että Phusionilla on erilaiset lämpötilavaatimukset kuin muilla DNA-polymeraaseilla. Phusionin alukkeen Tm on laskettu Breslauerin menetelmän perusteella, ja se on korkeampi kuin Taq- tai pfu-polymeraasien Tm. Optimaalisten tulosten saamiseksi Tm olisi laskettava entsyymin toimittajien verkkosivuilta löytyvien tietojen perusteella. Lisäksi Phusionin suuremmasta nopeudesta johtuen 15-30 sekuntia riittää yleensä kunkin kb:n monistamiseen kiinnostavasta sekvenssistä.
PCR:n jälkeen tuote on ladattava geelille (kuva 2D). Vastaava kaistale on leikattava ja DNA uutettava. PCR-tuotteen sekvensointi on välttämätöntä, koska PCR-tuote saattaa sisältää mutaatioita. Saatavilla on useita PCR-kloonauspaketteja, joista osa on esitetty taulukossa 2. Käytimme pJET1.2/blunt-kloonausvektoria (Thermo Scientific, patenttijulkaisu: US 2009/0042249 A1, Genbank-tunnistenumero EF694056.1) ja kloonasimme PCR-tuotteen linearisoituun vektoriin. Tämä vektori sisältää tappavan geenin (eco47IR), joka aktivoituu, jos vektori kiertyy. Jos PCR-tuote kuitenkin kloonataan letaaligeenin sisällä olevaan kloonauskohtaan, se katkeaa, jolloin bakteerit voivat kasvattaa pesäkkeitä muunnoksen jälkeen. Sirkularisoituneet vektorit, jotka eivät sisällä PCR-tuotetta, ilmentävät myrkyllistä geeniä, joka siis tappaa bakteerit estäen pesäkkeiden muodostumisen. Tämän jälkeen bakteeriklooneja viljellään, plasmidi-DNA eristetään peräkkäin ja sekvensoidaan. Eristetyn plasmidin laatu on olennaista optimaalisten sekvensointitulosten kannalta. Eristimme plasmidi-DNA:ta yhteensä 1,5 ml:sta viljeltyjä bakteereja (saanto 6 μg DNA:ta; OD 260/280 = 1,86; OD 260/230 = 2,17) käyttämällä plasmidien minipreparaatiosarjaa (QIAGEN). Koko PCR-prosessi, mukaan lukien PCR-tuotteen kloonaus sekvensointivektoriin ja bakteerien transfektio sekvensointivektorilla voidaan tehdä yhdessä päivässä. Seuraavana päivänä bakteerikloonit viljellään yön yli ennen kuin ne lähetetään sekvensointia varten.
Sekvensointidatan analysointi
Sekvensointiyritykset ilmoittavat sekvensointidatan yleensä FASTA-tiedostona ja myös valmiina nukleotidisekvensseinä sähköpostitse. Sekvenssianalyysiin voidaan käyttää seuraavia verkkosivustoja:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://xylian.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi
Tässä keskitytään ensimmäiseen verkkosivustoon. Napsauta tällä verkkosivulla ”nucleotide blast” -vaihtoehtoa (kuva 4A). Uusi ikkuna avautuu. Oletusarvoisesti ”blastn” (blast nucleotide sequences) -vaihtoehto on merkitty (kuva 4B). Rastita sitten ”Align two or more sequences” (Kohdista kaksi tai useampi sekvenssi) -kohdan takana oleva ruutu. Nyt näkyviin tulee kaksi laatikkoa. Lisää ”Enter Query Sequence” -laatikkoon (ylempi laatikko) haluamasi kiinnostavan geenin sekvenssi, jota reunustavat restriktiokohdat, jotka olet jo suunnitellut PCR-alukkeille. Syötä ”Enter Subject Sequence” -laatikkoon (alempi laatikko) sekvenssi tai lataa FASTA-tiedosto, jonka olet saanut sekvensointiyritykseltä. Napsauta sitten sivun alaosassa olevaa ”BLAST”-painiketta. Muutaman sekunnin kuluttua tulokset näkyvät toisella sivulla. Osa kohdistustiedoista on esitetty kuvassa 4C. Tulkinnassa on otettava huomioon seuraavat seikat: 1) identtisten nukleotidien lukumäärän (näkyy kohdassa ”Identities”) on oltava yhtä suuri kuin kiinnostavan geenin nukleotidien lukumäärä. Esimerkissämme tdTomato-geenin nukleotidien lukumäärä yhdessä restriktioentsyymipaikkojen ja Kozak-sekvenssin kanssa oli 735. Tämä vastaa ilmoitettua lukumäärää (kuva 4C). 2) Sekvenssin identiteetin (kohdassa ”Identities”) pitäisi olla 100 %. Toisinaan sekvenssi-identiteetti on 100 %, mutta identtisten nukleotidien määrä on odotettua pienempi. Näin voi tapahtua, jos yksi tai useampi alkunukleotidi puuttuu. Muista, että kaikissa sekvensointitekniikoissa on virheprosentti. Sanger-sekvensoinnissa tämä virhetaso vaihtelee 0,001 prosentista 1 prosenttiin. Nukleotidin vaihtuminen, poistuminen tai lisääminen voidaan tunnistaa analysoimalla sekvensointituloksia. Jos sekvenssi-identiteetti ei ole 100 prosenttia, plasmidi olisi sekvensoitava uudelleen, jotta PCR:n virheet voidaan erottaa yksinkertaisista sekvensointivirheistä. 3) Aukkoja (kohdassa ”Aukkoja”) ei saisi esiintyä. Jos aukkoja esiintyy, plasmidi olisi sekvensoitava uudelleen.
PCR-tuotteen sekvenssianalyysi NCBI:n BLAST-alustaa käyttäen. (A) NCBI:n BLAST-verkkosivulla on valittu ”nucleotide blast” -vaihtoehto (merkitty soikealla viivalla). (B) ”blastn”-vaihtoehto näkyy oletusarvoisesti (merkitty ympyrällä). Kiinnostavan geenin sekvenssi (jota reunustavat restriktiokohdat, jotka on aiemmin suunniteltu PCR-alukkeille) ja PCR-tuote lisätään ”Enter Query Sequence” ja ”Enter Subject Sequence” -kenttiin. Sekvenssit voidaan ladata myös FASTA-tiedostoina. (C) Näytetään 60 ensimmäisen nukleotidin nukleotidikohdistus. Kaksi sekvenssianalyysin kannalta tärkeää kohtaa on merkitty soikeilla viivoilla.
Lukulukeman keskimääräinen pituus eli lukupituus on Sanger-sekvensoinnissa vähintään 800-900 nukleotidia. Koko geenin sekvensointiin on käytettävä pJET-vektorissa yhtä eteen- ja yhtä taaksepäin suuntautuvaa aluketta. Nämä alukkeet voivat tavallisesti kattaa enintään 1800 bp:n kokoisen geenin. Jos geenin koko on suurempi kuin 1800 bp, jokaista 800 ylimääräistä nukleotidia kohti on suunniteltava ylimääräinen alukke. Koska luotettava emäskutsu ei ala heti alukkeen jälkeen, vaan noin 45-55 nukleotidia alukkeesta virtaussuuntaan, seuraava eteenpäin suuntautuva aluke olisi suunniteltava siten, että se alkaa noin 700 nukleotidin kuluttua geenin alusta. Näiden alukkeiden suunnitteluun voidaan käyttää erilaisia verkkosivuja, kuten seuraavia:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/sequencing_primer_design
Koska PCR-tuotteen pituus oli 735 bp, sen koko oli tässä esimerkissä hyvin pJET-sekvensointialukkeiden kantaman sisällä.
Sekvenssinvarmennetun kloonin valinnan jälkeen vektori- ja inserttiplasmidit digestoitiin AgeI- ja SalI- restriktioentsyymeillä (kuva 5). Tätä seurasi fragmenttien geelipuhdistus ja ligointi. Kompetentin E. colin transformaatio ligointiseoksella tuotti useita klooneja, jotka seulottiin restriktioentsyymeillä. Arvioimme kahdeksan kloonia, jotka kaikki sisälsivät tdTomato-insertin (kuva 6). On tärkeää valita kloonit, jotka ovat suuria. Satelliittikloonit eivät välttämättä sisällä oikeaa konstruktiota. Käytimme nopeaa plasmidien minipreparaatiosarjaa (Zymo Research) plasmidin uuttamiseen 0,6 ml:sta bakteerisuspensiota. Saanto ja puhtaus olivat tyydyttäviä restriktioentsyymipohjaista seulontaa varten (2,3 μg DNA; OD 260/280 = 1,82; OD 260/230 = 1,41). Laajamittaista plasmidipuhdistusta varten käytettiin maxi-preparation kittiä (QIAGEN) plasmidin uuttamiseksi 450 ml:sta bakteeriviljelmää (saanto 787 μg DNA; OD 260/280 = 1,89; OD 260/230 = 2,22). Odotettavissa oleva saanto pBR322-alkuisen plasmidin eristämisestä 1,5 ml:sta ja 500 ml:sta bakteeriviljelmää on noin 2-5 μg ja 500-4000 μg DNA:ta.
Vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttitietokarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttitietokarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttikarttojen vektori- ja inserttipitoisuuksien vektori- ja inserttipitoisuuksia. PCR-tuotteen insertio plasmidin kloonauskohtaan rikkoo myrkyllisen geenin eco47IR eheyden ja mahdollistaa siirtogeenipositiivisten kloonien kasvun. Plasmidi leikattiin AgeI- ja SalI-entsyymeillä, jolloin saatiin kaksi 3 kb:n ja 0,7 kb:n kokoista fragmenttia. 0,7 kb:n fragmenttia (tdTomaattigeeni) käytettiin inserttinä kloonausta varten. (B) Kuva vektoriplasmidista. Plasmidi leikattiin AgeI- ja SalI-entsyymeillä, jolloin syntyi kaksi 4,9 kb:n ja 0,7 kb:n kokoista fragmenttia. 4,9 kb:n fragmenttia käytettiin kloonausvektorina. AMP: Ampisilliiniresistenssigeeni; PRE: posttranskriptiivinen säätelyelementti; MPSV: myeloproliferatiivisen sarkoomaviruksen promoottori.
Lopullisen plasmidin seulonta restriktioentsyymeillä. Kuvassa on havainnollistettu lopullinen plasmidi. Seulontaa varten plasmidi leikattiin BsiwI-entsyymillä, jolloin syntyi kaksi 4,8 kb:n ja 0,8 kb:n kokoista fragmenttia. AMP: Ampisilliiniresistenssigeeni; PRE: posttranskriptiivinen säätelyelementti; MPSV: myeloproliferatiivisen sarkoomaviruksen promoottori.
Joillain plasmideilla on taipumus rekombinoitua bakteeri-isännän sisällä synnyttäen insertioita, deletioita ja rekombinaatioita. Näissä tapauksissa recA-puutteellisen E. colin käyttö voi olla hyödyllistä (taulukko 1). Lisäksi jos GOI on myrkyllinen, bakteerien inkubointi alhaisemmissa lämpötiloissa (25-30 °C) ja ABLE C- tai ABLE K -kantojen käyttö saattaa kiertää ongelman.
Virustuotanto ja kohdesolujen transduktio
Kloonatun geenin in vitro -ekspression tutkimiseksi HEK293T-soluja transfektoitiin plasmideilla, jotka koodasivat tdTomato-geeniä, alfaretroviraalista Gag/Pol:ia ja vesikulaarisen stomatiittiviruksen glykoproteiinikuorta (VSVG). Nämä solut, jotka ovat peräisin ihmisen alkiomunuaisesta, ovat helposti viljeltäviä ja helposti transfektoitavia. Siksi niitä käytetään laajalti bioteknologiassa ja geeniterapiassa viruspartikkelien tuottamiseen. HEK293T-solut on jaettava joka toinen päivä lämpimällä väliaineella. Ne eivät saa saavuttaa 100 prosentin konfluenssia optimaalisten tulosten saavuttamiseksi. Hyvän transfektiotehokkuuden saavuttamiseksi näitä soluja on viljeltävä vähintään viikon ajan, jotta ne olisivat log-faasissa. Transfektiotehokkuus oli 22 %, mikä määritettiin tdTomaton ilmentymisen perusteella fluoresenssimikroskopialla 24 tuntia myöhemmin (kuva 7A-B). Jotta saataisiin aikaan tdTomato-geeniä ilmentävä hiiren leukemiasolulinja immunoterapiatutkimuksia varten, C1498-leukemiasolut transdusoitiin juuri kerätyllä viruksella (36 tuntia transfektion jälkeen). Kuvantamistutkimukset (kuva 7C) ja virtaussytometrinen analyysi (kuva 7D) neljä päivää transduktion jälkeen vahvistivat tdTomato-geenin ilmentymisen suurimmassa osassa soluja.
Kloonatun geenin in vitro -ekspression arviointi. (A, B) HEK293T-solut transfektoitiin Gag/Pol-, VSVG- ja tdTomato-plasmideilla. TdTomato-geenin ilmentymistä arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla. Fluoresenssikuvat asetettiin kirkkaankenttäkuvan päälle positiivisesti transdusoitujen solujen erottamiseksi. Transfektion tehokkuus määritettiin tdTomato-geenin ilmentymisen perusteella 24 tunnin kuluttua. Kontrollina käytettiin transfektoimattomia HEK293T-soluja (sininen histogrammi). (C, D) Hiiren leukemiasolulinja C1498 transdusoitiin tuoreella viruksella. Neljä päivää myöhemmin transgeenin ilmentymistä arvioitiin fluoresenssimikroskopialla (C) ja virtaussytometrialla (D). Kontrollina käytettiin transduktoimattomia C1498-soluja (sininen histogrammi). Mittakaavapalkit edustavat 30 μm.
.
Vastaa