Tulokset

Maksimaalisen emissioaallonpituuden löytämiseksi AMC:n fluoresenssin intensiteetin seuraamiseksi trypsiinin pilkkomisen jälkeen mitattiin eksitaatio- ja emissiospektrit, jotka on esitetty kuvassa 1. Suurin emissioaallonpituus on 440 nm.

Emissiospektri (sininen) ja fluoresenssispektri (punainen) 50 µmol/L AMC
Kuva 1. AMC:n emissio- ja fluoresenssispektri. 50 µmol/L AMC:n emissio- (sininen) ja fluoresenssispektrit (punainen).

Ensyymiliuoksen mitatun fluoresenssin intensiteetin vakioimiseksi eristetyn AMC:n konsentraatioon tehtiin titraus ja mitattiin fluoresenssi. 2,5 ml:n entsyymiliuokseen lisättiin 0,5 ml:n aliquotteja 50 µmol/L AMC-liuosta, ja eristetyn AMC:n alku- ja loppupitoisuudet on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1. Eristetyn AMC:n alku- ja loppupitoisuudet. Eristetyn AMC:n pitoisuudet ennen ja jälkeen fluoresenssin intensiteetin standardoinnin.5

1 2.5 5 10 20 20 40

Trypsiinin aktiivisuuden kinetiikka saatiin tämän jälkeen mittaamalla eristetyn AMC:n fluoresenssin intensiteettiä trypsiinin pilkkoessa trypsiinin irrottaessa substraattia. Kuvassa 2 on esitetty aikajaksomittaus sen jälkeen, kun 0,5 ml vaihtelevia Boc-Gln-Ala-Arg-MCA-substraattiliuoksen konsentraatioita oli lisätty 2,5 ml:aan entsyymiliuosta.

Fluoresenssin intensiteetti entsyymiliuokseen lisättyjen vaihtelevien substraattikonsentraatioiden yhteydessä. Substraattipitoisuudet ovat taulukossa 1 esitettyjä lopullisia pitoisuuksia.
Kuva 2. Entsyymiliuokseen lisättyjen erilaisten substraattipitoisuuksien fluoresenssin intensiteetti. Substraattikonsentraatiot ovat taulukossa 1 esitettyjä lopullisia konsentraatioita.

Kinetics Analysis -ohjelman avulla piirrettiin Lineweaver-Burk-käyrästö (kuva 3) kuvan 2 fluoresenssiaikamittauksista. Lineweaver-Burkin kuvaajasta saadaan entsyymin kineettiset parametrit, kuten reaktion maksiminopeus, Vmax, ja Michaelis-Mentenin vakio, Km. Vmax kuvaa reaktionopeutta, kun entsyymi on kyllästetty substraatilla, kun taas Km ilmaisee substraattimäärän, jolla saavutetaan reaktion maksiminopeus. Vmax oli 35 270 nmol/l-min-1 ja Km oli 5,99. Viivan yhtälö oli 1/v = 0,000270 – 1/ + 0,0000284.

Lineweaver-Burk plot
Kuva 3. Lineweaver-Burk-kaavio.