Immunosytokemian menetelmät, tekniikat ja protokollat

ICC:n pääsivu > Solujen kiinnitys

Solujen kiinnitys

Solujen kiinnittämisen ja permeabiloimisen avulla varmistetaan, että vasta-aine pääsee vapaasti käsiksi antigeeniinsä. Yleensä solujen fiksaatiovahvuudet ja -ajat ovat huomattavasti lyhyempiä kuin paksummilla, rakenteellisesti monimutkaisilla kudosleikkeillä. Immunosytokemiaa varten näytteen valmisteluun kuuluu lähinnä kohdesolujen kiinnittäminen objektilasille. Täydellinen fiksaatio immobilisoi antigeenit säilyttäen samalla autenttisen solu- ja alisoluarkkitehtuurin ja sallien vasta-aineiden esteettömän pääsyn kaikkiin soluihin ja alisolukompartimentteihin. Yleisesti käytetään monenlaisia fiksatiiveja, ja menetelmän oikea valinta riippuu tutkittavan antigeenin luonteesta ja käytettävän vasta-aineen ominaisuuksista. Fiksointimenetelmät jakautuvat yleensä kahteen luokkaan: orgaaniset liuottimet ja ristisilloitusreagenssit. Orgaaniset liuottimet, kuten alkoholit ja asetoni, poistavat lipidit ja kuivattavat soluja ja saostavat samalla soluarkkitehtuurin proteiinit. Ristisilloitusreagenssit (kuten paraformaldehydi) muodostavat molekyylien välisiä siltoja, yleensä vapaiden aminoryhmien välityksellä, ja luovat näin verkottuneiden antigeenien verkoston. Ristisilloittavat reagenssit säilyttävät solun rakenteen paremmin kuin orgaaniset liuottimet, mutta ne voivat vähentää joidenkin solun osien antigeenisyyttä ja vaativat permeabilointivaiheen lisäämistä, jotta vasta-aine pääsee näytteeseen. Molemmilla menetelmillä tapahtuva fiksaatio voi denaturoida proteiiniantigeenejä, ja tästä syystä denaturoituja proteiineja vastaan valmistetut vasta-aineet voivat olla käyttökelpoisempia solujen värjäyksessä. Erilaisia fiksaatiomenetelmiä on kuvattu. Sopiva fiksaatiomenetelmä on valittava sovelluksen mukaan.

1. Asetonifiksaatio

  • Fiksaa solut -20 °C:n asetonissa 5-10 minuuttia.

  • Asetonifiksaation jälkeen ei tarvita permeabilointivaihetta.

2. Metanolifiksaatio

  • Fiksaa solut -20 °C:n metanolissa 5-10 minuuttia.

  • Metanolifiksaation jälkeen ei tarvita permeabilointivaihetta.

3. Etanolifiksaatio

  • Fiksaa solut jäähdytettyyn 95 %:n etanoliin, 5 %:n jääetikkahappoon 5-10 minuutiksi.

4. Metanoli-asetonifiksaatio

  • Fiksaatio jäähdytetyssä metanolissa, 10 minuuttia -20 °C:ssa.

  • Poistetaan ylimääräinen metanoli.

  • Permeabiloi jäähdytetyllä asetonilla 1 minuutti -20 °C:ssa.

5. Metanoli-asetoniseos-fiksaatio

  • 1:1 metanolin ja asetonin seos.

  • Tehdään seos tuoreena ja fiksoidaan soluja -20 C:ssa 5-10 minuuttia.

6. Metanoli-etanoliseos-fiksaatio

  • 1:1 metanolin ja etanolin seos.

  • Valmistetaan seos tuoreena ja fiksoidaan soluja -20 C:ssa 5-10 minuuttia.

7. Formaliinifiksaatio

  • Fiksaa solut 10 %:ssa neutraalipuskuroidussa formaliinissa 5-10 minuutin ajan.

  • Huuhtele lyhyesti PBS:llä.

  • Permeabiloidaan 0,5 %:lla Triton X-100:lla 10 minuutin ajan.

8. Paraformaldehydi-Triton-fiksaatio

  • Fiksaatio 3-4-prosenttisessa paraformaldehydissä 10-20 minuutin ajan.

  • Huuhtele lyhyesti PBS:llä.

  • Permeabiloi 0,5 %:lla Triton X-100:lla 10 minuuttia.

9. Paraformaldehydi-metanoli-fiksaatio

  • Fiksaatio 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 10-20 minuuttia.

  • Huuhtele lyhyesti PBS:llä.

  • Permeabilointi jäähdytetyllä metanolilla 5-10 minuuttia -20 °C:n lämpötilassa.