Tulokset ja keskustelu

Yleinen TE-domeenin rakenne. Vaikka eristetyn TE-domeenin rakenne, joka ratkaistiin, edustaa kahta itsenäistä molekyyliä (1 ja 2) epäsymmetrisessä yksikössä (taulukko 1), domeeni puhdistettiin ja se oli täysin aktiivinen monomeerinä (Z.G. ja B.C., julkaisemattomat tiedot). Natiivinen ihmisen FAS on järjestäytynyt head-to-tail-antiparalleeliseksi homodimeeriksi (1), kuten hiljattain on visualisoitu elektronikryomikroskopian (kryo-EM) kartoissa (31). Tämä järjestely asettaisi FAS-monomeerien kaksi TE-domeenia toistensa vastakkaisiin päihin, jolloin dimeerin muodostumisella ei olisi toiminnallista merkitystä. Näistä syistä dimeeri on kiteytymisen artefakti. Jäljempänä pidetään molekyylin 1 rakennetta edustavana rakenteena.

Ihmisen FAS:n TE-domeeni koostuu kahdesta osa-alueesta (A ja B) (kuva 1). Suurempi osa-alue A (≈23 kDa) koostuu kahdesta amino- (tai N-) ja karboksyyli- (tai C-) terminaalipäästä lähtevästä ei-yhtenäisestä segmentistä (kuvat 1, 2, 3). Väliin jäävä segmentti kuuluu pienempään (≈9 kDa) osa-alueeseen B. Osa-alueella A on yleinen α/β-taitos, kun taas osa-alueella B on kokonaan α-helikaalinen motiivi. Koko rakenne koostuu yhdeksästä α-kierteestä ja kahdeksasta β-säikeestä (kuvat 1 ja 2). Suurin osa koko TE-domeenin rakenteesta voitiin sovittaa elektronitiheyteen, lukuun ottamatta kolmea segmenttiä ja yhtä glysiinijäännöstä, jotka on esitetty kuvissa 1, 2 ja 3 ja joiden tiheys puuttuu tai on heikko, mikä osoittaa niiden suurta liikkuvuutta. Kaikki epäjärjestyksessä olevat segmentit ovat liuotinalttiilla alueilla, eivätkä ne ole lähellekään mukana kiteisissä kontakteissa.

Ihmisen FAS TE:n kolme katalyyttistä jäännöstä (Ser-2308, His-2481 ja Asp-2338) ovat sidoksissa toisiinsa ja viereisiin jäännöksiin laajalla vetysidosverkolla (kuva 4). Ser-2308:n hydroksyyliryhmä osallistuu yhteistoiminnalliseen vetysidokseen, jossa se ottaa vastaan viereisen Tyr-2309:n amidirungon ja luovuttaa His-2481:n Nε2:lle. Tämä puolestaan helpottaisi Ser-2308:n aktivoitumista nukleofiiliksi ja auttaisi vakauttamaan oksyanionin tetraedrisen välituotteen, jonka odotetaan muodostuvan TE-katalyyttisen reaktion aikana, kuten seriinihydrolaaseissa nähdään. His-2481-jäännös (Nε2) on puolestaan vetysidoksissa Asp-2338:aan (Oδ2). Asp-2338 (Oδ1-atomi) muodostaa lisävetysidoksia sekä Ala-2448:n selkärangan amidin että Tyr-2462:n hydroksyyliryhmän kanssa. Tyr-2462 on täysin muuttumaton, kun taas Ala-2448 on osittain konservoitunut hyönteisistä nisäkkäisiin (kuva 3). Näin ollen näiden jäännösten ja katalyyttisen aspartaattijäännöksen välinen vuorovaikutus näyttää olevan tärkeää Asp-2338:n pitämiseksi paikallaan, mikä osoittaa edelleen tämän jäännöksen tärkeän roolin. Katalyyttisen paikan laaja vetysidosverkosto pitää entsyymin toimintavalmiina suuntaamalla ja sijoittamalla katalyyttiset jäännökset tarvittaviin asemiinsa, aivan kuten seriinihydrolaaseissa (40).

Palmitoyyliketjujen sitoutumispaikka ja ketjun pituuden spesifisyys. Saadaksemme käsityksen mekanismista, jolla FAS:n TE-domeeni säätelee ketjun pituuden spesifisyyttä, analysoimme TE-rakenteen katalyyttisen keskuksen lähellä olevan uran löytämiseksi, joka voisi ottaa vastaan pitkiä rasva-asyliketjujen substraatteja. Ilmeisesti on vain yksi ura, joka sijaitsee osa-alueiden A ja B välisellä rajapinnalla (kuva 5). Analyysi proshape-ohjelmalla (ks. Materiaalit ja menetelmät) vahvisti uran läsnäolon, jonka tilavuus on 186,9 Å3 ja pinta-ala 140 Å2 ja jonka distaalinen pää muodostaa taskun (kuva 5). Ura on lähellä TE-domeenin aminoterminaalia, joka on yhteydessä FAS:n ACP-domeeniin, joka pitää kasvavat asyyliketjut paikoillaan, jotta TE-domeeni voi skannata ne ja vapauttaa ne saavutettuaan optimaalisen 16 hiilen pituisen rasvahappoketjun. Suurin osa uraa reunustavista jäännöksistä on peräisin aladomeenin B ampifiilisestä kierteestä α8. Muut siihen vaikuttavat jäännökset ovat aladomeenin B kierteestä α5, aladomeenin A N-terminaalisesta kierteestä α1 ja aladomeenin A β2:n ja α2:n välisestä silmukasta. Uraa reunustavat jäännökset, jotka ovat luonteeltaan enimmäkseen hydrofobisia, koostuvat Phe-2418:sta, Ala-2419:stä, Ser-2422:sta, Phe-2423:sta ja Lys-2426:sta kierteestä α8, Phe-2370:stä ja Phe-2371:stä kierteestä α5, Leu-2222:sta, Leu-2223:sta ja Val-2224:stä kierteestä α1 sekä Ile-2250:stä ja Glu-2251:stä kierteestä β2:n ja α2:n välisestä silmukasta (kuva 5A ). Näistä jäämistä Ile-2250, Glu-2251 ja Lys-2426 ovat muuttumattomia eri lajeissa, kun taas Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 ja Phe-2423 ovat enimmäkseen konservoituneita (kuva 3). Muut jäännökset ovat täysin konservoituneita nisäkkäillä (kuva 3). Kaikki edellä mainitut havainnot yhdessä viittaavat siihen, että kahden osa-alueen välinen rajapinta on erinomainen rasvahappoketjujen sitoutumisalue. Kaksi koetta tehtiin, jotta saataisiin uskottavuutta tälle ehdotukselle ja jotta saataisiin käsitys rasva-asyliketjujen selektiivisyydestä.

Kuva 5. Rasvaketjujen selektiivisyys.

Lipidin sitoutumiskohta. (A) Stereonäkymä palmitoyyliä sitovan ehdokkaan urasta ensimmäisten 11-12 hiilen osalta ja tasku viimeisten 5-4 hiilen osalta. Heksadekyylisulfonyyli-inhibiittori on esitetty Corey-Pauling-Koltun tilantäytteisenä mallina (C, keltainen; O, punainen; S, vihreä). Sivuketjut, jotka reunustavat uraa, on esitetty pallo- ja keppihahmoina (C, keltainen; O, punainen; N, sininen). Sivuketjut, jotka muodostavat aktiivisen alueen, on myös esitetty pallo- ja keppihahmoina, joiden värimaailma on samanlainen kuin jäännösten. Uran pintakartta on esitetty vihreänä lankaverkkona. Uran muodostavat jäännökset on merkitty lukuun ottamatta Ile-2250:tä, joka ei näy, koska se jää inhibiittorin alle. Sulfonyyliryhmän ensimmäiset 11-12 hiiliatomia ovat liuottimella alttiina, ja 11. ja 12. hiiliatomit ovat taskun suulla. (B) Erilainen näkymä urasta ja taskusta. Nuolet merkitsevät kiertymiä siirryttäessä A:n näkymän orientaatiosta B:hen. Tämä näkymä osoittaa, että suurin osa heksadekyyli-inhibiittorin rasva-asyliketjusta on alttiina liuottimelle.

Aluksi osoitimme paikkaohjatulla mutageneesillä, että useiden TE-domeenin uraa ja taskua reunustavien jäännösten korvaaminen vähensi TE-aktiivisuutta, vaikkakin eri laajuisesti (taulukko 2).

Näytä taulukko:

  • View inline
  • View popup

Table 2. Mutaatiot kandidaatin sitoutumisurassa vähentävät TE:n aktiivisuutta

Toiseksi pystyimme mallintamaan C16-palmitoyyliketjua sisältävän inhibiittorin heksadekyylisulfonyyli-fluoridin (HDSF) sitoutumisen uraan. Mallinnusta ohjasivat tiedot palmitoyyliproteiini TE 1:n (PPT1) kiderakenteesta, jossa on kovalenttisesti sitoutunut heksadekyylisulfonaatti (HDS) (PDB-tunnuskoodi 1exw; viite 41), ja sitä täydennettiin energian minimoinnilla cns:ssä. Kuten TE:n, myös PPT1:n katalyyttinen kohta sisältää konservoituneen katalyyttisen kolmikon, joka koostuu seriinistä, histidiinistä ja aspartaatista. PPT1-HDS-kompleksin rakenne osoitti kovalenttisen sidoksen muodostumisen HDS:n rikkiatomin ja katalyyttisen seriinin happiatomin välille sekä rasva-asyliketjun läsnäolon proteiinin pitkässä, enimmäkseen hydrofobisessa pintaurassa (41). Mallinnettu kovalenttisesti sitoutunut HDS TE-rakenteessa (esitetty kuvassa 5) paljasti useita ligandin sitoutumisen piirteitä, joilla on tärkeitä toiminnallisia ja biokemiallisia vaikutuksia. HDS:n sovittaminen ei aiheuttanut merkittäviä uudelleenjärjestelyjä sitoutumiskohdan jäännöksissä. Palmitoyyliketju tekee jyrkän mutkan sulfonaattiryhmään nähden samalla tavalla kuin sidotun PPT1:n rakenteessa. 16 hiiliatomin palmitoyyliketju mahtuu hyvin uraan siten, että ensimmäiset ≈12 hiiliatomia ovat alttiina liuottimelle ja loput ≈4 hiiliatomia ovat sisäkkäin ja pysyvät paikallaan distaalisessa taskussa. Tämä istuvuus on täysin sopusoinnussa sen havainnon kanssa, että nisäkkäiden FAS TE katalysoi palmitiinihapon muodostumista päätuotteena (20). Viimeisten ≈4 hiiliatomien läsnäolo taskussa auttaa sitomaan rasvahappoketjun paikalleen palmitoyyliasyyliasyylisubstraatin hydrolyysiä varten. Sitoutumiskohdan luonne, jossa yhdistyvät avoin ura ja suljettu tasku, on ainutlaatuinen ja suunniteltu tämän TE:n spesifisyyttä varten. Havainto, jonka mukaan nisäkkäiden FAS:ien TE-domeenilla ei ole merkittävää aktiivisuutta alle 14 hiiliatomin pituisia rasva-asyliketjuja kohtaan (20), voidaan selittää sillä, että sitoutuminen ei ole tuottavaa, koska sidoksen puuttuminen ja altistuneiden lyhyempien ketjujen suurempi liikkuvuus ovat syynä siihen. Palmitoyyliketjun viimeiset ≈4 hiiliatomia vievät osittain distaalisen taskun, jolloin tilaa jää vain kahdelle muulle hiiliatomille. Tämä tulos on yhdenmukainen sen kanssa, että yli 18 hiiliatomia pidemmillä mallisubstraateilla aktiivisuus vähenee dramaattisesti (20). On epäselvää, sijoitetaanko C16- ja C18-rasva-asyliketjujen viimeiset ≈4- ja ≈6-hiiliatomit valmiiksi muodostuneeseen taskuun kahden osa-alueen väliin, kuten sitoutumattoman muodon rakenteessa nähdään, vai sidotaanko ne aluksi domainin avoimeen muotoon, joka sitten käy läpi osa-alueiden välisen nivelen taipumisliikkeen rasvahappoketjujen lopullisten hiiliatomien sulkemiseksi sisäänsä ja aktiivisen keskuksen alueen tuottavan konfiguraation muodostamiseksi.

Huomattavia ponnisteluja on tehty TE:n kiteyttämiseksi erilaisten pitkäketjuisten rasvahappojen analogien kanssa (esim, palmitoyyli-CoA, myristoyyli-CoA, stearoyyli-CoA, palmitiinihappo, heksadekyylisulfonyylifluoridi ja palmitiinihappo), mutta pitkäikäisiä stabiileja kompleksirakenteita ei löytynyt. Useimmat kompleksit, kuten riippumattomat entsyymiaktiivisuus- tai radioaktiiviset sitoutumismääritykset liuoksessa osoittivat, dissosioituvat 5 minuutista 1 tuntiin, joten ne eivät sovellu kiteyttämis- tai kiteiden liotuskokeisiin.

Cryo-EM Fit of TE Structure. Vaikka ihmisen FAS-dimeerin 20 Å:n kryo-EM-rekonstruktiorakenne on kuvattu (31), FAS-alayksikön N- ja C-terminaalisesta polariteetista ei ollut mitään viitteitä, lukuun ottamatta aiempaa vasta-ainemerkinnästä saatua viitteitä siitä, että FAS:n TE-domeeni sijaitsi koko rakenteen jommassakummassa päässä (42). Yritimme arvioida polariteettia alustavasti telakoimalla manuaalisesti pienemmän (32 kDa) ihmisen FAS TE-domeenirakenteen, joka sijaitsee FAS-alayksikön C-terminaalisessa päässä, ja suuremman (42 kDa) E. coli β-ketoasyylisyntaasi I:n (tai KSI) kiderakenne (PDB ID-koodi 1ek4) (43), joka on nisäkkään FAS:n N-terminaalisen KS-domeenin läheinen homologi, kryo-EM-massatiheyden pääksi ja jalaksi nimetyn monomeeriyksikön kumpaankin päähän (kuva 6). TE-rakenne sopii hyvin jalaksi nimetyn osarakenteen kärkeen, kun taas KSI sopii parhaiten pääksi nimetyn osarakenteen kärkeen (kuva 6). FAS-dimeerissä ACP-domeeni on vuorovaikutuksessa sekä saman monomeerin TE-domeenin että vastakkaisen monomeerin ketoasyylisyntaasidomeenin kanssa, mikä johtaa kahden aktiivisen keskuksen muodostumiseen dimeerin molempiin päihin. TE-domeenin ja KS-domeenin homologin orientaatio sopi parhaiten jalkaan ja päähän, mikä mahdollisti ACP-molekyylin sekä tilallisen että toiminnallisen vuorovaikutuksen molempien proteiinien kanssa. Kun rakenteita vaihdettiin, sovitus oli paljon huonompi, jolloin osa KSI:n osista jäi tiheyden ulkopuolelle ja TE:n sovituksessa oli suurempi tilavuus huomioon ottamatta jäänyttä tiheyttä (kuva 6).

Kuva 6. Sovitus.

TE:n (vihreä selkärangan jälki) ja KSI:n (ruskea jälki) alustava sovitus 20 Å:n resoluution kryo-EM-massatiheyteen. Tiheydestä näkyvät alarakenteet on nimetty Head, Torso ja Foot. TE-jälki sopii parhaiten Foot-alkurakenteeseen, kun taas KSI-runkojälki sopii parhaiten Head-alkurakenteeseen. Sekä KSI:n että TE:n paras sovitus on ympyröity punaisella. Massatiheyden alaosassa olevat TE:n ja KSI:n selkärangan jäljet sopivat huonommin päähän ja jalkaan. Intaktin FAS:n aiempien proteolyyttisten pilkkomiskokeiden perusteella tunnistettiin kolme domeenia: domeeni I, joka käsittää KS-AT/MT-DH-entsyymikeskukset ja linkkialueen; domeeni II, joka käsittää ER-KR-ACP-alueen; ja domeeni III, joka liitetään TE:hen (1, 2). Pää- ja vartalo-osarakenteet, jotka ovat olennaisesti sulautuneet yhteen, voisivat vastata domeenia I ja osia domeenista II, ja Jalka voisi edustaa loput domeenista II ja domeeni III.

Johtopäätökset. Tärkeimmät johtopäätökset, jotka voidaan tehdä ihmisen FAS:n TE-domeenin kiderakenteesta, ovat seuraavat. (i) TE koostuu kahdesta aladomeenista, jotka eroavat toisistaan kooltaan ja taittomotiiveiltaan. (ii) Suuremmassa A-aladomeenissa on α/β-motiivi, kun taas pienempi B-aladomeeni on kokonaan kierteinen. (iii) A-alialueella on Ser-, Asp- ja His-jäännösten katalyyttinen triadi. (iv) Pitkä ura, jossa on distaalinen tasku osa-alueen B ja osa-alueen A välillä, muodostaa rasva-asyliketjun sitoutumiskohdan. Tämän paikan geometria ja luonne ovat sopusoinnussa TE:n korkean spesifisyyden kanssa C16-C18-rasva-asylisubstraatteja kohtaan. Ura toimii kuin viivotin, joka mittaa oikean substraatin pituuden. (v) TE:n alustava sovittaminen ehjään ihmisen FAS:n kryo-EM-rakenteeseen viittaa alayksiköiden uskottavaan N- ja C-päätteen väliseen napaisuuteen. Tarvitaan kuitenkin korkeamman resoluution kryo-EM-kartta, jotta sovitus voidaan todentaa tarkemmin ja jotta FAS:n toimintaa voidaan analysoida perusteellisesti.