Materiaalit

Puhdasta duloksetiinilaatua (DLX) tarjosi lahjanäytteinä Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, Intia. Hydroksipropyylimetyyliselluloosan (HPMC) laadut 100 M, 4CM ja 15 M CR toimitti avokätisesti Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, Intia. Kaikki muut tutkimuksessa käytetyt laboratoriokemikaalit ja reagenssit olivat analyyttistä reagenssilaatua. Koko tutkimuksen ajan käytettiin kaksoistislattua vettä. Polyetyleeniglykoli 400 ostettiin S.D. Fine Chem Ltd:ltä, Boisar, Intia. Dinatriumvetyfosfaatti, kaliumdivetyfosfaatti ja natriumhydroksidi ostettiin CDH Ltd:ltä, New Delhi, Intia. Absoluuttinen etanoli saatiin Changshu Yangyuan Chemicalilta, Kiina. n-oktanoli ostettiin E-Merck (India) Ltd:ltä, Mumbai, Intia. Dialyysimembraani150 ostettiin Hi Media Laboratories Ltd:ltä, Mumbai. Kaikki materiaalit ja jauheet säilytettiin tyhjiössä huoneenlämmössä.

Varusteet

UV-spektrit tallennettiin Perkin Elmer lambda 15 UV/visible -spektrofotometrillä UV/visible-alueella 190-600 nm. Franz-diffuusiokennokokoonpano hankittiin Permegear, Inc:ltä, USA. Infrapunaspektrofotometri FT-IR-8300 hankittiin Perkin Elmer PE RX 1 FTIR-spektrofotometriltä. Differentiaalisen pyyhkäisykalorimetrian (DSC) spektrit saatiin käyttämällä DSC-mallia Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Tutkimussentrifugi oli REMI Equipments, Mumbai, Intia. pH-mittari CyberScan pH 510 hankittiin Eutech Instrumentsilta, Intia.

Preformulointitutkimukset

Fosfaattipuskuroidun keittosuolaliuoksen valmistaminen pH 7.4

0,19 g kaliumdivetyfosfaattia, 2,38 g dinatriumvetyortofosfaattia ja 8,0 g NaCl liuotettiin tislattuun veteen, ja tilavuus täytettiin 1000 ml:ksi tislatulla vedellä. Puskurin pH säädettiin 7,4:ään.

Duloksetiinihydrokloridin kvantitatiivinen määritys

Duloksetiinipitoisuus analysoitiin UV-spektrofotometrisesti fosfaattipuskuroidusta suolaliuoksesta, jonka pH oli 7,4. Kantaliuoksen skannaus suoritettiin UV-alueella 190-400 nm. λ max saatiin aallonpituudella 289 nm. Duloksetiinihydrokloridin kantaliuos A (250 μ/ml) valmistettiin liuottamalla 0,0250 g lääkettä fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (pH 7,4) 100 ml:aan. Lisäksi valmistettiin duloksetiinin sarjalaimennokset 1 μg/ml:stä 100 μg/ml:iin laimentamalla kantaliuokset A ja B fosfaattipuskurilla (pH 7,4). Laimennosten absorbanssiarvot merkittiin DLX:n λ max:n kohdalla, ts, 289 nm:ssä nollaksi otettua fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (pH 7,4) vastaan, ja kalibrointikäyrä piirrettiin.

Duloksetiinihydrokloridin fysikaalis-kemiallinen karakterisointi

Sulamispisteen määrittäminen

Pieni määrä duloksetiinihydrokloridia otettiin kapillaariputkeen (joka oli sulatettu toiselta päältään) ja asetettiin sulamispistemittalaitteistoon, ja sulamislämpötila rekisteröitiin. Tarkoitusta varten tehtiin kolme erillistä mittausta, joista saatiin keskiarvo.

Jakaantumiskertoimen määritys

Duloksetiinihydrokloridin jakaantumiskerroin määritettiin oktanoli-vesi -järjestelmässä (Wells 2002). Molemmat faasit otettiin 1:1 v/v-suhteessa ja kyllästettiin vastavuoroisesti vesihauteen ravistimessa 37 °C:ssa, minkä jälkeen molemmat faasit erotettiin toisistaan. Kymmenen milligrammaa lääkeainetta lisättiin 20 ml:n esikyllästetyn orgaanisen faasin ja 20 ml:n esikyllästetyn veden seokseen ja ravistettiin 10 minuuttia. Tämän jälkeen pulloja pidettiin 37 °C:ssa 24 tuntia ajoittain ravistellen. Tämän jälkeen seos sentrifugoitiin vesipitoisen ja ei-vesipitoisen faasin erottamiseksi toisistaan. Näistä kahdesta faasista analysoitiin erikseen duloksetiini spektrofotometrisesti. Lääkeaineen jakautumiskerroin ”K o/w” laskettiin sitten oktanoli- ja vesifaasin lääkeainepitoisuuksien suhteesta.

Lääkkeen ja polymeerin vuorovaikutustutkimukset

Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopia

Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopiaa (FTIR) käytettiin puhtaan lääkeaineen DLX:n, DLX:n ja HPMC:n fysikaalisen seoksen (15 CR, 100 M ja 4 M) sekä lääkeaineella ladattujen transdermaalisten laastareiden analysoimiseen KBr-granulaatikkomenetelmää käyttäen. Kaikki näytteet skannattiin 400-4000 cm-1.

Differentiaalinen pyyhkäisykalorimetria

Mahdolliset lääkeaineen ja käytetyn polymeerin väliset vuorovaikutukset analysoitiin puhtaan lääkeaineen duloksetiinihydrokloridin ja formulaation (HPMC + lääkeaine) DSC-termogrammeista, jotka saatiin DSC-mallilla DSC-malli Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Kaikki näytteet suljettiin litteäpohjaisiin alumiinipannuihin ja kuumennettiin lämpötila-alueella 25-300 °C nousunopeudella 5 °C/min.

Transdermaalisten laastareiden valmistus

Transdermaaliset kalvot, jotka sisälsivät duloksetiinihydrokloridia, valettiin lasilevylle liuotinhöyrystysmenetelmällä, jossa käytettiin HPMC:n eri laatuluokkia (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) pehmentäjän läsnäollessa ja ilman. Pehmittimenä käytettiin kaikissa tapauksissa PEG 400:a (5 %). Taulukossa 1 esitetään erityyppisten laastareiden kaavat ja koostumus. Duloksetiinihydrokloridi (60 mg) liuotettiin vesi-metanoliliuottimen seokseen (7:3). Lääkeainematriisi valmistettiin liuottamalla HPMC:tä eri pitoisuuksina (1 % ja 1,5 % w/v) samaan liuotinjärjestelmään. Liuosta pidettiin häiriintymättömänä 24 h. Sen jälkeen liuos kaadettiin ruiskun ja neulan avulla halkaisijaltaan 5,0 cm:n lasirenkaaseen, joka asetettiin lasipinnalle. Liuottimen annettiin haihtua 6 tunnin ajan 60 °C:n lämpökaapissa. Laastareita säilytettiin ilmatiiviissä astiassa huoneenolosuhteissa 7 päivää ennen käyttöä.

Taulukko 1 Duloksetiini HCl:n formuloitujen transdermaalisten järjestelmien kaavat ja koostumus

Transdermaalisten laastareiden arviointi

Fyysinen ulkonäkö

Kaikki valmistetut laastarit tarkastettiin silmämääräisesti värin, kirkkauden, joustavuuden ja sileyden osalta.

Laastareiden paksuus

Lääkkeellä täytettyjen laastareiden paksuus mitattiin ruuvimikrometrillä kolmesta eri kohdasta laastareita. Kullekin lääkeaineella täytetylle laastarille laskettiin kolmen lukeman keskiarvot ja keskihajonta-arvot.

Painon tasaisuus

Laastareille tehtiin painonvaihtelutesti punnitsemalla kaikki laastarit digitaalisella vaa’alla. Määritykset tehtiin kolmena kappaleena kunkin formulaation osalta. Tämän jälkeen laskettiin keskimääräiset paino- ja keskihajonta-arvot.

Pinnankestävyystutkimus

Pinnankestävyystutkimus suoritettiin sen arvioimiseksi, että valmistetuilla transdermaalisilla laastareilla on sileä pinta ja että ne eivät supistu ajan myötä. Kalvosta leikattiin kolme pituussuuntaista kaistaletta kolmesta eri kohdasta. Kunkin kaistaleen pituus mitattiin ja tasaisuuden epätasaisuudesta johtuva pituuden vaihtelu määritettiin määrittelemällä supistumisprosentti, jossa 0 % supistumista vastaa 100 % tasaisuutta. Supistumisprosentiksi saatiin (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Tässä l 1 on kunkin kaistaleen alkupituus ja l 2 on kunkin kaistaleen loppupituus.

Taivutuskestävyys

Tämä testi tehtiin pehmittimen tehokkuuden ja eri polymeereillä valmistetun laastarin lujuuden tarkistamiseksi. Taittumiskestävyys määritellään taittojen lukumääräksi, joka tarvitaan minkä tahansa polymeerilaastarin rikkoutumiseen. Taittokestävyys mitattiin käsin taittamalla toistuvasti pieni kaistale kalvoa (2 × 2 cm) samasta kohdasta, kunnes se murtui. Taittokestävyyden arvoksi saatiin se, kuinka monta kertaa laastari voitiin taittaa samasta kohdasta ilman, että se rikkoutui/halkeili. Testiä varten otettiin kolme laastaria kutakin tyyppiä.

Kosteuden imeytymisprosentti/vesihöyryn imeytyminen

Kosteuden imeytymisprosenttikoe tehtiin kalvojen fysikaalisen stabiilisuuden ja eheyden tarkistamiseksi erittäin kosteissa olosuhteissa. Valmistetut kalvot (3,14 cm2) punnittiin yksitellen tarkasti ja altistettiin 85 ± 5 %:n suhteelliselle kosteudelle eksikaattorissa, joka sisälsi 100 ml kyllästettyä kaliumkloridiliuosta huoneenlämmössä. Tänä aikana kalvot punnittiin säännöllisin väliajoin 24, 48 ja 72 h. Kosteuden imeytymisprosentti määritettiin seuraavasta kaavasta:

Kosteuspitoisuusprosentti

Tämä testi tehtiin myös kalvojen eheyden tarkistamiseksi kuivissa olosuhteissa. Yksittäisiä transdermaalisia kalvoja (joiden pinta-ala oli määritelty) säilytettiin eksikaattorissa, joka sisälsi sulatettua vedetöntä kalsiumkloridia huoneenlämmössä. Tänä aikana kalvot punnittiin säännöllisin väliajoin 24, 48 ja 72 tunnin välein. Kosteusprosentti määritettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa:

Vesihöyryn läpäisy

Vesihöyryn läpäisynopeus (WVTR) määritellään kalvon pinta-alayksikön läpi aikayksikössä läpäisevän kosteuden määräksi. Läpäisykennoina käytettiin tilavuudeltaan ja halkaisijaltaan samanlaisia lasipulloja. Kennot pestiin asianmukaisesti ja kuivattiin uunissa. Kumpaankin injektiopulloon laitettiin noin 1 g vedetöntä sulatettua kalsiumkloridia, ja laastari kiinnitettiin injektiopullon reunan päälle teipillä. Injektiopullot punnittiin ja asetettiin eksikaattoreihin, jotka sisälsivät kyllästettyä kaliumkloridiliuosta 84 prosentin suhteellisen kosteuden ylläpitämiseksi. Solut poistettiin eksikaattoreista ja punnittiin ensimmäisen, toisen, kolmannen, neljännen, viidennen, kuudennen ja seitsemännen päivän jälkeen. Vesihöyryn läpäisynopeus määritettiin seuraavasti:

$$$ W.\ V.\ T. = WL/S $$

Jossa W on läpäisevän vesihöyryn paino, L on laastarin paksuus ja S on altistunut pinta-ala neliösenttimetreinä.

Pinnan pH

Lappuja pidettiin lasiputkissa kosketuksissa 0,5 ml:n kaksoistislattua vettä kanssa 1 tunnin ajan ja niiden annettiin turvota. Yhdistetty lasielektrodi tuotiin lähelle laastarin pintaa ja pH-lukemat otettiin 1 minuutin tasapainottumisajan jälkeen.

Lääkeainepitoisuuden määritys

Kustakin valmistetyypistä leikattiin 2 × 2 kokoisia paloja ja ne laitettiin 100 ml:aan fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta, jonka pH oli 7,4. Sisältöä sekoitettiin magneettisesti 2 h. Tämän jälkeen liuos suodatettiin Whatman-suodatinpaperin (0,45 μ) läpi ja laimennettiin sopivasti fosfaattipuskurisuolaliuoksella pH 7,4. Tämän jälkeen liuoksesta analysoitiin absorbanssi 289 nm:ssä käyttäen plasebolaastaria nollapisteenä. Absorbanssiarvoista määritettiin lääkeainepitoisuus.

In vitro lääkeaineen vapautuminen

Franzin diffuusiosolua käytettiin transdermaalisten formulaatioiden in vitro -luonnehdintaan. Tämä on luotettava menetelmä, jolla voidaan ennustaa lääkeaineen kulkeutumista ihon läpi paikallisesti käytettävistä formulaatioista. Diffuusiokennon reseptoriosasto täytettiin 30,0 ml:lla fosfaattipuskuroitua keittosuolaliuosta (pH 7,4), ja in vitro -lääkkeen vapautumistutkimukset suoritettiin synteettisellä sellofaanikalvolla. Valmistetut formulaatiot levitettiin luovuttajaosaston kalvoon ja levitettiin tasaisesti sellofaanikalvolle. Kokoonpanoa pidettiin jatkuvasti 37,0 ± 2,0 °C:ssa 50 rpm:n kierrosnopeudella. Näytteet (1,0 ml:n alikvootteja) otettiin sopivin aikavälein (0, 0,5, 1, 1,5, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 ja 24 tuntia) ja täydennettiin väliaineella, jotta reseptorifaasin tilavuus pysyi 30 ml:ssa. Näytteet analysoitiin spektrofotometrisesti 289 nm:ssä.

Lääkkeen läpäisevyys/ex vivo-tutkimukset

Lääkkeen läpäisevyystutkimukset tehtiin urospuolisten Wistar-rottien iholla. Rotat uhrattiin selkärangan sijoiltaanmenolla. Ihonäytteet leikattiin, poistettiin ja pestiin normaalilla suolaliuoksella. Tarttuva rasva ja sidekudos poistettiin tylppäkärkisillä pihdeillä. Ihoa pidettiin normaalissa suolaliuoksessa 6 tunnin ajan. Rotan ihon karvat ajeltiin varovasti, jotta vältettäisiin perifeeriset vauriot. Franzin diffuusiokennon reseptoriosasto täytettiin 30 ml:lla fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (pH 7,4). Valmistettuja formulaatioita levitettiin rotan iholle luovuttajaosastossa. Kokoonpanon lämpötila pidettiin jatkuvasti 37 ± 2 °C:ssa ja sekoitusnopeutta säädettiin 50 rpm. Näytteet (5 ml:n annokset) otettiin sopivin aikavälein (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ja 24 tuntia) ja korvattiin samalla määrällä elatusainetta, jotta reseptorifaasin tilavuus pysyi 30 ml:ssa. Näytteet analysoitiin spektrofotometrisesti λ max 289 nm:ssä.

ihoärsytystutkimukset

Eettinen lupa koe-eläinten käsittelyyn saatiin Institutional Animal Ethical Committee (IAEC), Panjab University, Chandigarh, ja tutkimukset suoritettiin hyväksytyn protokollan mukaisesti.

Albiino Wistar -rotat pidettiin häkeissä, ja niillä oli vapaata ylimäärää tavanomaista laboratorio-ruokavaliota ja vettä. Rottien vatsan selkäpuolen iho ajeltiin huolellisesti välttäen perifeerisiä vaurioita ennen 24 tunnin tutkimusta. Transdermaalinen laastari kiinnitettiin alastomalle iholle ja peitettiin ei-herkistävällä mikrohuokoisella teipillä. Ihoa ärsyttävänä vakioaineena käytettiin 0,8-prosenttista (v/v) formaliinin vesiliuosta. Eläimille laitettiin uusi laastari joka päivä 7 päivään asti. Valmiste poistettiin 7 päivän kuluttua; eryteemapisteet kirjattiin ja niitä verrattiin standardiin. Eryteeman pistemäärä luettiin ja kirjattiin Draizen pisteytysmenetelmällä (Draize et al. 1944) seuraavasti: pistemäärä 0, jos eryteemaa ei ole, pistemäärä 1, jos eryteema on hyvin lievä (vaaleanpunainen), pistemäärä 2, jos eryteema on hyvin selväpiirteinen (tumma vaaleanpunainen), pistemäärä 3, jos eryteema on keskivaikea tai vakava (vaaleanpunainen), ja pistemäärä 4, jos eryteema on vakava (tummanpunainen).

Tietojen analysointi

N:nnen näytteen osalta V s on otetun näytteen tilavuus, V t on reseptoriväliaineen kokonaistilavuus, C c on korjattu konsentraatio, C u on n:nnen näytteen korjaamaton konsentraatio ja C i on korjaamaton konsentraatio. Lisäksi korjattua pitoisuutta käytettiin laskettaessa vapautuneen lääkeaineen määrän ja vapautuneen lääkeaineen prosenttiosuuden arvot kullakin näytteenottokerralla yhdessä lääkeaineen vapautumisnopeuden kanssa.

Läpäisevyyskerroin on lääkeaineen läpäisynopeus kalvon/ihon läpi μg/cm2/h. Läpäisevyyskerroin laskettiin kuljetetun lääkeaineen prosenttiosuuden ja ajan välisen kuvaajan kaltevuudesta seuraavasti: P = kaltevuus × V d/S

Tässä V d on luovutusliuoksen tilavuus millilitroina ja S on kudoksen pinta-ala neliösenttimetreinä.

Virtaus (J-arvo) määritellään materiaalin määräksi, joka virtaa yksikkökohtaisen poikkileikkausesteen läpi yksikköajassa. Se lasketaan seuraavasti: