Eluointikokeen asettaminen

Mitä yhteistä on DNA-minipreparaateilla ja proteiinien immunoprecipitointikokeilla? Ne alkavat eri tavalla, mutta ne päättyvät samaan, kriittiseen vaiheeseen – eluutioon. Mutta mitä eluutio tarkalleen ottaen on, ja mikä on sen tarkoitus?

Terminologia

Aloitetaan ensin perusterminologiasta:

Eluutio – yhden aineen erottaminen toisesta pesemällä liuottimella.

Adsorbentti – kiinteä faasi, joka voi olla silikageeli mini-prep-kolonnien tapauksessa, mutta yleensä helmiä, jotka voidaan yhdistää kovalenttisesti vasta-aineisiin tai muihin ligandimolekyyleihin. ”Kiinteä faasi” ei välttämättä tarkoita seisovaa kolonnia; se voi olla eppendorfissa olevia helmiä, jotka on helppo pestä.

Affiniteetti – mitta, joka kuvaa adsorbenttimateriaalin kykyä sitoa haluamaansa molekyyliä (sitä, mitä yritetään eluoida). Mitä suurempi on kiinteän faasin affiniteetti valittuun biomolekyyliin (BOC), sitä tiukemmin molekyyli sitoutuu siihen. Et kuitenkaan halua, että sitoutuminen on irreversiibeliä; silloin eluointi on mahdotonta.

Eluentti – liuotin, joka poistaa BOC:n absorbentista.

Eluaatti – liuotin, joka sisältää adsorbentista poistetun BOC:n.

Materiaalin valmistelu

Valitsemasi molekyyli on absorboitava ennen eluointia ja samalla hankkiuduttava eroon kontaminaatiosta. Tämä on olennainen vaihe, sillä perinteinen viisaus muistuttaa meitä ”garbage in, garbage out”. Sinulla voi olla erinomaisia reagensseja eluointia varten, mutta jos näytteessäsi on liikaa asiaan liittymätöntä henkilökuntaa (tieteellinen termi on ”gunk”), se tukkii adsorptiomateriaalin. Kiinteän faasin kyllästyminen estää BOC:si imeytymisen ja kontaminoi sitten eluaatin. Tehokkaat lyysi- ja puhdistusvaiheet ovat olennaisen tärkeitä eluutiokokeesi onnistumisen kannalta.

On tärkeää määrittää esiabsorptiomateriaalin tilavuus. Absorptiomateriaalin läpi kulkevan lysaatin tilavuus ei saisi ylittää 3 – 5 pylvään tilavuutta. Imeytysaineen läpi kulkevan lysaatin suuri tilavuus lisää kokeen kestoaikaa sekä roskan imeytymisen todennäköisyyttä. Monissa tapauksissa lysaatin alkuperäistä tilavuutta kannattaa pienentää suodattamalla tai fraktioimalla. Näin ollen lysaatin tilavuus määrää kolonnin koon.

Adsorptiomateriaalin valinta riippuu kiinnostavan molekyylin kemiallisesta koostumuksesta. Biomolekyylien adsorptioon liittyy yleensä enemmän tai vähemmän spesifinen vuorovaikutus substraatin ja molekyylin välillä. Esimerkiksi DNA imeytyy minikolonniin negatiivisesti varautuneiden DNA-fosfaattiryhmien ja positiivisesti varautuneiden piihappohiukkasten välisen ionisen vuorovaikutuksen vuoksi.

Proteiinit adsorboituvat tavallisesti IgG:llä päällystettyyn sefaroosiin tai magneettihelmiin.

Ensimmäisen lysaatin levittämisen jälkeen pylväs ei voi missään vaiheessa kuivua. Tämä ”paistaa” molekyylisi absorboivaan aineeseen ja häiritsee pylvään eheyttä. Jos sinulla ei ole aikaa jatkaa koetta, täytä pylväs yhteensopivalla puskurilla ja pysäytä virtaus.

Pesu

Kiinteän faasin pesun tarkoituksena on poistaa asiaan liittymätön materiaali, mutta jättää kiinnostava molekyyli pylvääseen. Selektiivinen erottelu saavutetaan usein käyttämällä puskuria, jonka ionivahvuus on alhainen (esim. alhainen suolapitoisuus). Pesupuskurin tilavuuden tulisi olla lähellä alkuperäisen materiaalin määrää, ja sen tulisi olla vähintään 3-5 tilavuutta pylväästä.

Monien tilavuuksien pylvään läpi kulkeneen pesupuskurin jälkeen kontaminaatiot ovat kuitenkin huuhtoutuneet pois, eivätkä lisähuuhtelut paranna prep:n laatua. Lisäksi alat menettää kohdemateriaalia.

Eluutio

Image: Kromatogrammi, jossa näkyy Sephadex G-50 Superfine -menetelmällä erotetun Arabidopsis-supernatantin UV-absorptioprofiili. Geelin tilavuus: 500 ml; kolonnin pituus: 700 mm; kolonnin halkaisija: 30 mm; eluentin virtausnopeus: 12 ml/tunti; fraktiotilavuus: 8,0 ml; fraktioiden lukumäärä: 95; näytetilavuus: 5 ml; erotuslämpötila: 4 °C; eluointipuskuri: 20 mM Tris-HCl, 1 mM NaN3; pH 8,0. Image credit: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chrom_SephG-50.tif

Eluutio itsessään toimii, koska pylvään ja substraatin väliset sidokset katkaistaan (esim. käyttämällä korkeaa suolapitoisuutta tai eluentin korkeaa lämpötilaa). Eluointi tehdään yleensä pienessä puskurimäärässä, joka on yhteensopiva näytteen säilytyksen ja jatkosovellusten kanssa.

DNA:n eluointi mini-prep-kolonnista on yksinkertaisin tapaus: yksi puskurimäärä poistaa lähes kaiken DNA:n. Eluaatin DNA-konsentraatio on kääntäen verrannollinen käytettyyn eluointipuskuriin: mitä enemmän puskuria käytetään, sitä pienempi on lopullinen DNA-konsentraatio. Useimmat valmistajat suosittelevat kuitenkin tässäkin tapauksessa ylimääräisen tilavuuden käyttämistä kaiken DNA:n poistamiseksi.

Kolonnien osalta eluutionopeus on kriittinen. Liian hidas nopeus lisää molekyylin hajoamismahdollisuuksia; liian nopea ja fraktioiden erottelua ei tapahdu.

Suuren tilavuuden pylväitä varten sinun on kerättävä eluaattifraktioita, koska molekyylisi jakautuu niiden välillä. Ensimmäinen fraktio sisältää pesu- ja eluointipuskurin sekoituksen ja mahdollisen kontaminaation, jota pesupuskuri ei ole poistanut.

Voit seurata OD:tä molekyylityypillesi (260nm/280nm DNA:lle) ja tehdä blot-analyysin molekyylisi spesifisestä konsentraatiosta kussakin fraktiossa. Yksinkertaisimmassa tapauksessa molekyylisi jakauma noudattaa yksinkertaista kellokäyrää, mutta siinä voi olla yksi tai useampia teräviä piikkejä.

Johtopäätöksenä, kun tunnet kokeesi perusparametrit (absorbointiaine, pylvään koko, pesupuskuri, eluointipuskuri, virtausnopeus, fraktioiden lukumäärä) ja yleiset eluutioperiaatteet, voit määrittää eluution onnistuneesti.

Lisätietojen saamiseksi etsi artikkeli, jossa muut tutkijat tekivät jotain samanlaista – mieluiten samaa molekyyliä, mutta samanlainen riittää – ja sovita se omiin olosuhteisiisi.