Doksisykliini on anti-inflammatorinen ja estää stafylokokin eksotoksiinin aiheuttamia…Induced Cytokines and Chemokines

Stafylokokin toksinen sokkioireyhtymä-toksiini 1 (TSST-1) ja rakenteellisesti samankaltaiset eksotoksiinit ovat bakteereiden eksotoksiineja, jotka sitoutuvat suoraan päähistokompatibiliteettikompleksin II-luokan molekyyleihin antigeenin esittelevillä soluilla (1, 5, 8, 18, 23) ja jotka aktivaatioivat spesifisiä vβ-alkioita eksplikoivia T-alkioyksityisrakenteita ilmentäviä T-alkioita (7). Näitä toksiineja kutsutaan superantigeeneiksi, koska ne kykenevät stimuloimaan polyklonaalisesti suuria T-solupopulaatioita (1, 4, 7, 14). Näin ollen stafylokokin eksotoksiinit (SE) ovat voimakkaita immuunijärjestelmän aktivaattoreita ja aiheuttavat ihmisillä erilaisia sairauksia, kuten ruokamyrkytyksiä, toksista sokkia ja autoimmuunisairauksia (1, 2, 6, 12, 14, 22). Niiden vuorovaikutus immuunijärjestelmän solujen kanssa johtaa proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien massiiviseen tuotantoon (1, 4, 15, 17). Sytokiinit tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α), interleukiini-1 (IL-1) ja gammainterferoni (IFN-γ) ovat keskeisiä välittäjiä superantigeenin aiheuttamassa toksisessa sokissa (1, 21). Sekä TNF-α:lla että IL-1:llä on voimakas immunostimuloiva vaikutus, ja ne toimivat synergisesti IFN-γ:n kanssa tehostaen immuunireaktioita ja edistääkseen kudosvaurioita (16). Näin ollen nämä sytokiinit ovat patogeenisia suurina pitoisuuksina in vivo ja ovat vastuussa SE:n aiheuttamasta kuumeesta ja toksisesta sokista (13, 14, 18, 19).

Doksisykliini on laajakirjoinen antibiootti, jota käytetään laajalti sekä gramnegatiivisten että grampositiivisten mikro-organismien aiheuttamiin infektioihin. Se toimii bakteriostaattisena aineena ja on erittäin tehokas monia mikro-organismeja vastaan, mukaan lukien Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis ja Yersinia pestis. Doksisykliini kuuluu tetrasykliini-antibioottiperheeseen, jonka jäsenillä on osoitettu olevan muita biologisia vaikutuksia, jotka ovat riippumattomia niiden antimikrobisista vaikutuksista (10). Doksisykliini estää forboli-12-myristaatti-13-asetaatti-välitteistä matriksin metalloproteinaasi 8:a (MMP-8) ja MMP-9:ää ihmisen endoteelisoluissa (11). Doksisykliini vähentää myös elastiinin hajoamista ja vähentää MMP-aktiivisuutta aneurysman sairauden mallissa (3). Hiljattain osoitettiin, että doksisykliini estää IL-1β:n tuotantoa lipopolysakkaridilla käsitellyissä sarveiskalvon epiteeliviljelmissä samassa määrin kuin kortikosteroidit (25). In vivo doksisykliini suojasi hiiriä tappavalta endotoksemialta alentamalla sytokiinien ja nitraattien eritystä veressä (20). Tässä tutkimuksessa selvitettiin doksisykliinin moduloivaa vaikutusta stafylokokin superantigeenin aiheuttamaan T-solujen aktivaatioon ja sytokiinituotantoon ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisista soluista (PBMC).

Henkilön PBMC:t eristettiin Ficoll-Hypaque-tiheysgradienttisentrifugoinnilla normaalista ihmisluovuttajista peräisin olevasta heparinisoidusta verestä. PBMC:tä (106/ml) kasvatettiin 37 °C:ssa 24-kuoppalevyissä, jotka sisälsivät RPMI 1640 -mediaa ja 10 % lämpöinaktivoitua naudan sikiöseerumia. Soluja inkuboitiin joko SEB:n (200 ng/ml) tai TSST-1:n (200 ng/ml) kanssa 16 tunnin ajan, ja supernatantit kerättiin ja analysoitiin IL-1β:n, TNF-α:n, IL-6:n, IFN-γ:n, MCP-1:n, MIP-1α:n ja MIP-1β:n osalta. Sytokiinit ja kemokiinit mitattiin entsyymisidonnaisella immunosorbenttimäärityksellä sytokiini- tai kemokiinispesifisillä vasta-aineilla valmistajan ohjeiden mukaisesti (15, 17). Ihmisen rekombinantteja sytokiineja ja kemokiineja (20-1000 pg/ml) käytettiin standardeina kalibroinnissa kullakin levyllä. Kunkin määrityksen havaitsemisraja oli 20 pg/ml. Sytokiini- ja kemokiinitiedot ilmaistiin kaksoiskappaleiden keskiarvona ± standardipoikkeama (SD). Doksisykliini, jos se oli mukana, lisättiin samanaikaisesti stimuloivan aineen kanssa. Sytotoksisuutta mitattiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumisella sytosolista viljelmän supernatanttiin. LDH kvantifioitiin käyttämällä kolorimetristä sytotoksisuusmäärityssarjaa (Boehringer Mannheim) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vapautuvan LDH:n enimmäismäärä (100 %) saatiin lysoimalla soluja 1 % Triton X-100:lla. T-solujen proliferaatio määritettiin PBMC:llä (105/kuoppa), jotka kasvatettiin kolminkertaisesti SEB:llä tai TSST-1:llä (200 ng/ml), yhdessä doksisykliinin kanssa tai ilman, 48 tunnin ajan 37 °C:n lämpötilassa 96-kuoppaisissa mikrotiterilevyissä. Soluja pulssitettiin 1 μCi tymidiinillä (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) kuoppaa kohti viljelyn viimeisten 5 tunnin aikana aiemmin kuvatulla tavalla (15). Solut kerättiin lasikuitusuodattimille, ja sisäänrakennettu tymidiini mitattiin nesteskintillaatiolla. Kaikki tiedot analysoitiin merkitsevien erojen varalta Studentin t-testillä Stata-ohjelmalla (Stata Corp., College Station, Tex.). Doksisykliinillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien kontrolliryhmien välisiä eroja pidettiin merkitsevinä, jos P oli <0,05.

Seurauksena raportista, jonka mukaan doksisykliini esti lipopolysakkaridin indusoiman IL-1:n epiteelisoluissa ja esti letaalin endotoksemian in vivo (20, 25), testasimme hypoteesin, jonka mukaan tällä antibiootilla saattaisi olla suoria vaikutuksia SE:n indusoimiin sytokiineihin. Kuten kuvasta 1 käy ilmi, doksisykliini esti annosriippuvaisesti sytokiinien IL-1β, IL-6, TNF-α ja IFN-γ sekä kemokiinien MCP-1, MIP-1α ja MIP-1β tuotantoa PBMC:llä, jota inkuboitiin SEB:llä. Samanlainen annosriippuvainen sytokiinien ja kemokiinien väheneminen doksisykliinillä havaittiin myös TSST-1-stimuloidulla PBMC:llä (tietoja ei ole esitetty). Doksisykliinin estävä vaikutus SEB- tai TSST-1-välitteisiin sytokiineihin ja kemokiineihin, jotka saatiin seitsemältä normaalilta luovuttajalta peräisin olevalla PBMC:llä, on esitetty yhteenvetona kuvassa 2. MCP-1:n ja IFN-γ:n tuotanto estettiin kokonaan 50 μM doksisykliinillä. Tämä doksisykliinipitoisuus vähensi IL-1β:n, IL-6:n, TNF-α:n, MIP-1α:n ja MIP-1β:n määrää 15-22 %:iin, 37-41 %:iin, 21-25 %:iin, 10-15 %:iin ja 59-61 %:iin käsittelemättömien, SEB:llä tai TSST:llä stimuloitujen solujen pitoisuuksista. Myös TNF-β, jos sitä esiintyi, estyi 25 %:iin käsittelemättömien, SEB-stimuloitujen solujen tasosta. Doksisykliini ei ollut sytotoksinen PBMC:lle tällä pitoisuudella, mikä mitattiin trypan sinisen poissulkemisella ja laktaattidehydrogenaasin vapautumisen puuttumisella käsitellyistä soluista. Näiden sytokiinien ja kemokiinien täydellinen esto havaittiin suurilla doksisykliiniannoksilla (>0,1 mM). Samanlainen doksisykliinin aiheuttama annosvasteinen inhibitio havaittiin SEB:n pienemmillä pitoisuuksilla (1 ja 10 ng/ml) (tietoja ei ole esitetty).

Koska superantigeenit aiheuttavat myös T-solujen proliferaatiota, tutkittiin doksisykliinin vaikutusta SE:n aiheuttamaan T-solujen proliferaatioon. Kuvasta 3 nähdään, että doksisykliini esti SEB- ja TSST-1-stimuloitua T-solujen proliferaatiota annosriippuvaisesti saavuttaen 98 %:n eston 0,05 mM:n annoksella.

Tämä tutkimus osoitti, että doksisykliini esti tehokkaasti superantigeenien välittämän sytokiinien ja kemokiinien tuotannon ihmisen PBMC:ssä in vitro. Myös stafylokokin superantigeenien indusoima T-solujen proliferaatio tukahdutettiin kokonaan. Doksisykliinin aiheuttama proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien alaregulaatio SEB- ja TSST-1-stimuloidussa PBMC:ssä viittasi siihen, että doksisykliini saattaa vaikuttaa toksisen sokin patofysiologiaan. Nämä havainnot laajentavat muiden tutkijoiden havaintoja doksisykliinin immunomoduloivista vaikutuksista sen antimikrobisten vaikutusten lisäksi.

Doksisykliinin anti-inflammatorisiin vaikutuksiin saattaa liittyä useita molekyylimekanismeja, sekä transkriptio- että posttranskriptiomekanismeja (11, 26). Proinflammatoristen sytokiinien tukahduttamiseen saattaa liittyä doksisykliinin aiheuttama PKC-reitin alasäätely, kuten viittaa tutkimus sen vaikutuksista granulooman muodostumiseen (26). Ilmoitettu doksisykliinin estävä annos (10-15 μM), joka vähentää kollagenaasia, gelatinaasia ja muita metalloproteinaaseja in vitro (10, 11), on verrattavissa tässä tutkimuksessa käytettyyn annokseen, ja se on moninkertaisesti suurempi kuin se, joka havaittiin ihmisen seerumissa 200 mg:n päivittäisen oraalisen annostelun jälkeen (10, 24). Kliiniset tutkimukset osoittavat kuitenkin, että tämä annos oli riittävä vähentämään kollagenaasi- ja gelatinaasiaktiivisuutta ihmisen nivelrustouutteissa ex vivo (24). Subantimikrobisen doksisykliiniannoksen (20 mg kahdesti päivässä) on osoitettu estävän ientaskunesteen kollagenaasiaktiivisuutta (9). Lisäksi kokeellista endotoksemiaa koskevissa in vivo -tutkimuksissa doksisykliini ja muut tetrasykliinit todettiin tehokkaiksi tulehdussytokiinien alaregulaatiossa ja sokin estämisessä (20).

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että tässä esitetyt tulokset osoittavat, että doksisykliini alentaa proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien määrää, mikä viittaa sen potentiaaliseen käyttökelpoisuuteen superantigeenin aiheuttaman toksisen sokin hoidossa. Kliinisessä ympäristössä, jossa isäntä altistuu useille biologisille tekijöille, mukaan lukien sekä bakteereille että bakteerien eksotoksiineille, doksisykliinin käyttö tarjoaa lisäetuna sekä antimikrobisia että anti-inflammatorisia vaikutuksia.”