ARTIGOO ORIGINAL / ORIGINAL ARTICLE

DIAGNOSIS OF ALPHA-1-ANTITRYPSIN DEFICIENCY BY DNA ANALYSIS OF CHILDREN WITH LIVER DISEASE*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 ja Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Tausta – Alfa-1-antitrypsiinin puutos on perinnöllinen sairaus, joka periytyy yhteispainotteisesti autosomaalisessa muodossa. Alfa-1-antitrypsiinin puutos vaikuttaa pääasiassa keuhkoihin ja maksaan ja johtaa jälkimmäisessä tapauksessa vastasyntyneiden kolestaasiin, krooniseen hepatiittiin tai kirroosiin. Alfa-1-antitrypsiinin puutoksen tarkka diagnoosi voidaan tehdä biokemiallisella tai molekyylianalyysillä. Tavoite – Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia DNA-analyysin avulla alfa-1-antitrypsiinin puutoksen esiintymistä 12 lapsella, joilla epäiltiin olevan kyseinen puutos ja joilla oli sairauden laboratorio- ja kliinisiä piirteitä. Potilaat ja menetelmät – Tutkittiin 12 potilasta, jotka olivat iältään 3 kuukaudesta 19 vuoteen ja joiden seerumin alfa-1-antitrypsiinipitoisuus oli normaalia alhaisempi ja/tai joilla oli määrittelemättömän etiologian maksasairaus. Näiltä 12 lapselta tutkittiin alfa-1-antitrypsiinigeenin S- ja Z-mutaatioalleelit. Alfa-1-antitrypsiinigeenin järjestäytyminen analysoitiin monistamalla genomia polymeraasiketjureaktion avulla ja pilkkomalla se restriktioentsyymeillä Xmnl (S-alleeli) ja Taq 1 (Z-alleeli). Tulokset – Seitsemällä potilaalla 12:sta oli määrittelemättömän etiologian krooninen maksasairaus, ja viidellä muulla potilaalla oli alhaiset seerumin alfa-1-antitrypsiinipitoisuudet sekä diagnoosi vastasyntyneen kolestaasi ja/tai määrittelemättömän etiologian krooninen maksasairaus. Viidellä potilaalla 12:sta oli homotsygootti Z-alleeli (ZZ), ja kahdella oli S-alleeli ja toinen Z:stä poikkeava alleeli (*S). Johtopäätökset – Tulokset osoittavat, että alfa-1-antitrypsiinin puutos on suhteellisen yleinen lapsilla, joilla on määrittelemättömän etiologian krooninen maksasairaus ja/tai alhaiset alfa-1-antitrypsiinipitoisuudet (41,6 %). Oikea diagnoosi on tärkeä tehokkaan kliinisen seurannan ja geneettisen neuvonnan kannalta.

OTSIKOT ¾ Alfa-1-antitrypsiinin puutos. Molekyylidiagnoosi. Maksabiopsia.

TOIMINTA

Alfa-1-antitrypsiini (A1AT) on 52 kDa:n glykoproteiini, jota tuottavat pääasiassa hepatosyytit, jotka vapauttavat verenkiertoon 2 g tätä proteiinia päivässä(36). A1AT:n tärkein tehtävä on estää neutrofiilisen elastaasin, seriiniproteaasin, joka hydrolysoi keuhkojen elastiinikuituja, toimintaa(38). A1AT:aa koodaavan geenin mutaatiot tuottavat proteiinia, jolla ei ole inhiboivaa kykyä, ja ne voivat johtaa A1AT:n kertymiseen hepatosyyttien inkluusiosoluihin, jolloin tämän proteiinin normaalit seerumipitoisuudet pienenevät(4). Tämä puutos näkyy keuhkoemfyseemana, kroonisena keuhkoputkentulehduksena tai bronkiektasina(9). Mutanttisen A1AT:n kertyminen hepatosyytteihin voi johtaa myös vastasyntyneen kolestaasiin, krooniseen hepatopatiaan tai kirroosiin(33, 34).

A1AT-geeni on erittäin polymorfinen, ko-dominantti ja sijaitsee kromosomin 14 pidemmällä haaralla (14q 31-32.3)(20, 29). Tälle geenille on kuvattu 75¾5 alleelia (nimetty A-Z niiden isoelektristen pisteiden mukaan), jotka perustuvat seerumin isoelektriseen fokusointiin pH 4:n (anodi) ja pH 5:n (katodi) välillä polyakryyliamidigeeleissä. Yleiset variantit siirtyvät geelin keskelle ja kuuluvat siten M-perheeseen (”middle”). Puutteellinen muunnos, jonka LAURELL ja ERIKSSON kuvailivat alun perin vuonna 1963(21), siirtyy kohti katodia, ja sitä kutsutaan nimellä Z. Toinen muunnos, joka siirtyy geelissä hitaasti, on nimeltään S(5). Tämä polymorfinen ”lokus” tunnetaan yleisesti Pi (proteaasi-inhibiittori) -järjestelmänä. Useimmat variantit tuottavat määrältään ja laadultaan normaalia A1AT:tä(7, 8, 25). Joihinkin alleeleihin, kuten variantteihin S ja Z, liittyy kuitenkin puutostila, joka saavuttaa polymorfisia frekvenssejä kaukasialaisissa populaatioissa, ja on raportoitu tapauksia nolla-alleelista, jossa proteiinin tuotanto puuttuu kokonaan(10).

S-alleeli johtuu adeniinin korvautumisesta tiamiinilla geenin eksonissa III, mikä johtaa siihen, että glutamiinihappo asemassa 264 vaihtuu valiiniin ja sen seurauksena muodostuu epävakaa proteiinirakenne(10, 11, 19). Z-alleeli johtuu guaniinin korvautumisesta adeniinilla geenin eksonissa V kohdassa 342, ja se johtaa proteiinin muodostumiseen, joka kerääntyy hepatosyytin endoplasmisen retikulumin karhealle sisäpinnalle(6). Puutostilan diagnoosi tehdään yleensä seerumin proteiinipitoisuuden kvantifioinnin ja isoelektrisen fokusoinnin jälkeisen elektroforeettisen profiilin perusteella(23, 37). Tarkempi diagnoosi edellyttää geenianalyysiä DNA-pohjaisilla tekniikoilla(12, 14, 26).

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa S- ja Z-alleelin kantajat niistä potilaista, joilla epäiltiin olevan tämä puutos ja joilla oli tämän sairauden laboratorio- ja kliinisiä piirteitä.

POTILAAT JA MENETELMÄT

Potilaat

Potilaita

Helmikuun 1988 ja elokuun 1997 välisenä aikana suuri määrä potilaita ohjattiin pediatriseen gastroenterologiseen yksikköön (Pediatric Gastroenterological Service), Campinasin osavaltionyliopistoon (State University of Campinas, Campinas, SP, Brasilia) maksasairauksien tutkimista varten. Tästä määrästä vain 12 potilaalla ei ollut varmaa diagnoosia (negatiiviset tulokset virushepatiitille, autoimmuunihepatiitille ja Wilsonin taudille). Näille potilaille tehtiin A1AT:n molekyylianalyysi.

Menetelmät

1 ¾ Tutkimusprotokolla

2 – Maksabiopsia

Perkutaaniset maksabiopsiat otettiin MOWATin(24) kuvauksen mukaisesti paikallispuudutuksessa potilailta, jotka olivat paastonneet vähintään 4 tuntia, joilla oli laskimokovettumatauti ja joiden protrombiiniaktiivisuus oli normaali. Saatu fragmentti laitettiin välittömästi 10 prosentin formaliiniin, minkä jälkeen se käsiteltiin ja värjättiin hematoksyliini-eosiinilla, Massonin trikromilla, preussinsinisellä ja verkkokuitujen hopeakyllästyksellä. Erikoisvärjäyksessä käytettiin PAS:ia (Periodic acid-Schiff), jota seurasi käsittely diastaasilla. Eosinofiilien näköisten sytoplasman rakeiden pysyvyyttä diastaasin käytön jälkeenkin pidettiin positiivisena A1AT-puutokselle.

3 – Molekyylianalyysi

A1AT:n S- ja Z-mutaatioalleelien tutkimiseksi tehtiin DNA-uutto perifeerisen veren leukosyyteistä WOODHEADin ym. (39) kuvaaman menetelmän mukaisesti.

TULOKSET

Viisi tutkituista 12 lapsesta oli Z-homotsygootteja (ZZ), kun taas kahdella lapsella oli S-alleeli yhdessä toisen alleelin kanssa, joka ei ollut Z (*S). Taulukossa 1 esitetään potilaan ikä verinäytteenottohetkellä ja indikaatio, jonka perusteella päätettiin myöhempää analyysia varten. Kolmella potilaalla vastasyntyneiden kolestaasi oli kroonisen hepatopatian ensimmäinen ilmenemismuoto.

Taulukossa 2 esitetään seerumin ALT-, AP-, gGT- ja A1AT-pitoisuudet sekä molekyylitutkimuksen ja maksabiopsian tulokset.

Viidellä potilaalla, joilla oli ZZ-genotyyppi, seerumin A1AT-pitoisuudet olivat alentuneet, ja maksabiopsiassa todettiin kirroosi (yksi), vastasyntyneiden hepatiitti (kaksi), interlobulaaristen sappiteiden vähäisyys (yksi) ja krooninen hepatiitti (yksi). Viimeksi mainitussa tapauksessa (FSP) periportaalisissa hepatosyyteissä näkyi HE-värjäyksen jälkeen eosinofiilien näköisiä sytoplasmagranulaatioita, jotka vahvistettiin jälkikäteen PAS-positiivisuudella ja diastaasiresistenssillä (kuva 1). Kahdesta vastasyntyneiden kolestaasipotilaasta (EKBA ja RHBP) otettiin maksabiopsia, kun he olivat 10 viikon ja 13 viikon ikäisiä, ja niissä havaittiin eosinofiilisiä PAS-positiivisia, diastaasiresistenttejä palloja.

Kuvissa 2 ja 3 esitetään S- ja Z-alleelien monistamisen ja digestion tulokset.

KESKUSTELU

Alfa-1-antitrypsiinin puutos on yksi yleisimmistä geneettisistä häiriöistä, joka johtaa maksasairauteen lapsilla, ja se on yleisin geneettinen sairaus, joka vaatii maksansiirtoa(17, 28). A1AT:n puutosta esiintyy Pohjois-Amerikassa ja Pohjois-Euroopassa yhdellä vastasyntyneellä 1600-2000:sta(28, 31), mutta vain 10-15 %:lle tätä puutosta sairastavasta väestöstä kehittyy maksasairaus(32, 33). SVEGERin vuonna 1988 julkaiseman tutkimuksen(33) mukaan vastasyntyneiden aikana 11 prosentille potilaista, joilla on PIZZ-fenotyyppi, kehittyy ikterinen hepatiitti. Tässä tutkimuksessa kolmella A1AT-puutosdiagnoosin saaneella potilaalla oli vastasyntyneiden kolestaasi, ja kahdella näistä potilaista kolestaasia pidettiin idiopaattisena, ennen kuin puutos diagnosoitiin lopullisesti. Kirjallisuudessa ilmoitetuista idiopaattisen vastasyntyneen hepatiitin tapauksista 5-10 prosenttia johtuu A1AT:n puutteesta(3).

Viidellä tutkituista potilaista, joilla oli tämä puutos, seerumin A1AT-pitoisuudet olivat alle normaalin alarajan. Tämä testi ei kuitenkaan ehdottomasti vahvistanut taudin diagnoosia. Koska A1AT on akuutin tulehdusvaiheen proteiini, sen synteesi lisääntyy tulehdus-/infektiotiloissa, kasvaimissa, raskaudessa ja estrogeenejä ja kortikosteroideja käyttävän hoidon aikana(16, 22). Seerumin A1AT-pitoisuudet pienenevät vastasyntyneiden hengitysvaikeusoireyhtymässä, maksan vajaatoiminnan loppuvaiheessa, kystisessä fibroosissa ja tilanteissa, joissa on suuri proteiinikato(15). SZ-genotyypin seerumipitoisuudet, jotka teoriassa voivat johtaa maksasairauksiin, ovat yleensä normaalit.

Kun vastasyntyneen kolestaasi esiintyy, on lähtökohtaisesti tarpeen tehdä erotusdiagnoosi ekstrahepaattisen sappitieatresian kanssa. Kliininen anamneesi mahdollistaa riittävän diagnoosin 83 prosentissa tapauksista(1) , ja diagnoosin tarkkuuden parantamiseksi tarvitaan erityisiä tutkimuksia. Näistä tutkimuksista maksabiopsia on erittäin tärkeä. A1AT-puutospotilaiden maksabiopsiassa havaitut histopatologiset muutokset voivat olla samoja kuin idiopaattisessa vastasyntyneiden hepatiitissa tai ekstrahepaattisessa sappitieatresiassa(24). Pääosin periportaaliset, hepatokystan sisäiset pallot, jotka ovat vahvasti PAS-positiivisia diastaasin pilkkomisen jälkeen, ovat hyödyllinen osoitus A1AT-puutoksesta(13, 18, 27). Näitä palloja on kuitenkin vaikea tunnistaa ennen 12. viikkoa syntymästä(35). Tässä tutkimuksessa potilaan EKBA:lla oli maksakudoksessa 10 viikon iässä edellä mainitut ominaisuudet omaavia palloja. Potilaalla JCI (13 viikon iässä) ei havaittu tällaisia palloja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että globulusten esiintyminen olisi tutkittava erityisvärjäyksellä ennen 12 viikon ikää saaduista maksan palasista, vaikka negatiivinen tulos ei poista A1AT-puutoksen mahdollisuutta. Biokemiallista analyysia ei käytetty tässä tutkimuksessa, koska tarkempi DNA-analyysi oli mahdollinen.

A1AT-puutos on suhteellisen yleinen lapsilla, joilla on määrittelemättömän etiologian maksasairaus. Tämä diagnoosi on aliarvioitu, luultavasti siksi, että käytetään epätarkkoja diagnostisia menetelmiä. Molekyylianalyysillä saadaan tarkempi diagnoosi, ja siitä voi olla hyötyä myös sellaisten potilaiden geneettisessä neuvonnassa, joilla on etiologialtaan tuntematon maksasairaus.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMO – Racional – A deficiência de alfa-1-antitripsina é uma doença genética transmitida de forma autossômica co-dominante. Pääasiallisiin kliinisiin oireisiin kuuluu keuhkoahtaumatauti ja hepatiitti. Viimeksi mainittua voidaan kutsua vastasyntyneiden kolestaasiksi, krooniseksi hepatiitiksi tai sirkroosiksi. Lopullinen diagnoosi tehdään alfa-1-antitrypsiinin biokemiallisella analyysillä tai molekyylianalyysillä. Objetivo – Tutkitaan 12 lapsen ryhmässä, jossa epäillään alfa-1-antitripsinan puutosta, puutoksen esiintymistä DNA-analyysin avulla, jotta diagnoosi voidaan tehdä lopullisesti, sekä alfa-1-antitripsinan puutosten ja tavattujen kliinisten ja laboratoriotutkimusten ominaisuuksien välistä yhteyttä. Tapaukset ja menetelmät – Alfa-1-antitrypsiinigeenin S- ja Z-mutaatioalleeleja tutkittiin 12 potilaalla, joiden ikä vaihteli 3 kuukaudesta 19 vuoteen, jotka lähetettiin Universidade Estadual de Campinasin (SP, Brasilia) lasten gastroenterologian poliklinikalle, koska seerumin alfa-1-antitrypsiiniarvot olivat normaalia alhaisemmat ja/tai heillä oli maksasairaus ilman määriteltyä etiologiaa. DNA-analyysi tehtiin käyttäen muunnettua polymeraasiketjureaktion geenimonistusmenetelmää, jossa luodaan restriktiokohdat entsyymeille Xmnl (S-alleeli) ja Taq l (Z-alleeli). Tulokset – Lähetetyistä 12 potilaasta 7:llä oli krooninen maksasairaus ilman määriteltyä etiologiaa, ja viidellä muulla oli alhainen seerumin alfa-1-antitrypsiiniannos, johon liittyi vastasyntyneiden kolestaasidiagnoosi ja/tai krooninen maksasairaus tuntemattomasta etiologiasta. Tässä 12 potilaan ryhmässä havaittiin viisi homotsygoottista Z-potilasta (ZZ), ja kahdella oli S-alleeli yhdessä toisen, Z:stä poikkeavan alleelin kanssa (*S). Johtopäätökset – Nämä tulokset osoittavat, että A1AT-puutos on suhteellisen yleinen etiologia lapsilla, joilla on krooninen maksasairaus ilman määriteltyä etiologiaa ja/tai alhainen seerumin A1AT-annos (41,6 %). Puutosdiagnoosin varmuuden merkitys on perusteltua paitsi potilaan kliinisen seurannan myös geneettisen neuvonnan kannalta.

DESCRITORIT ¾ Alfa-1-antitrypsiinin puutos. Molekyylidiagnoosi. Maksabiopsia.

1. Alagille D. Kolestaasi kolmen ensimmäisen elinkuukauden aikana. Prog Liver Dis 1979;6:471-85.

2. Andresen BS, Knudsen I, Jensen PKA, Gregersen N. Kaksi uutta ei-radioaktiiviseen polymeraasiketjureaktioon perustuvaa kuivattujen veripilkkujen, genomisen DNA:n tai kokonaisten solujen määritystä alfa-1-antitrypsiinigeenin Z- ja S-mutaatioiden nopeaan ja luotettavaan osoittamiseen. Clin Chem 1992;38:2100-7.

5. Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Alfa-1-antitrypsiinin puutoksen molekulaarinen perusta. Am J Med 1988;84:13-31.

6. Carlson JA, Rogers RB, Sifers R. PiZ-alfa-1-antitrypsiinin kertyminen aiheuttaa maksavaurioita siirtogeenisillä hiirillä. J Clin Invest 1989;83:1183-90.

8. Cox DW, Woo SL, Mansfield T. DNA:n restriktiofragmentit, jotka liittyvät alfa 1-antitrypsiiniin, osoittavat, että puutosalleeli PI Z on peräisin yhdestä ainoasta paikasta. Nature 1985;316:79-81.

9. Crystal RG, Brantly ML, Hubbard RC, Curiel DT, States DJ, Holmes MD. Alfa 1-antitrypsiinigeeni ja sen mutaatiot. Kliiniset seuraukset ja hoitostrategiat. Chest 1989;95:196-208.

11. Curiel D, Brantly M, Curiel E, Crystal RG. Alfa-1-antitrypsiinin Nullmattawa-geenin aiheuttama alfa-1-antitrypsiinin puutos. Insertiomutaatio, joka tekee alfa-1-antitrypsiinigeenistä kykenemättömän tuottamaan alfa-1-antitrypsiiniä. J Clin Invest 1989;83:1144-52.

12. Dermer SJ, Johnson EM. Nopea DNA-analyysi alfa-1-antitrypsiinin puutoksesta: parannetun menetelmän soveltaminen mutatoituneen geenisekvenssin monistamiseen. Lab Invest 1988;59:403-8.

13. Deutsch J, Becker H, Auböck L. Maksasairauden histopatologiset piirteet alfa 1-antitrypsiinin puutoksessa. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:8-12.

14. Dubel JR, Finwick R, Hejtmancik JF. Denaturoiva gradienttigeelielektroforeesi alfa 1-antitrypsiinigeenistä: sovellus prenataalidiagnostiikkaan. Am J Med Genet 1991;41:39-43.

15. Evans HE, Levi M, Mandl I. Seerumin entsyymi-inhibiittoripitoisuudet hengitysvaikeusoireyhtymässä. Am Rev Resp Dis 1970;101:359-63.

18. Ishak KG. Maksan morfologia perinnöllisissä aineenvaihduntasairauksissa. Sem Liver Dis 1986;6:246-58.

20. Lai EC, Kao FT, Law ML, Woo SL. Alfa-1-antitrypsiinigeenin ja sekvenssiin liittyvän geenin osoittaminen ihmisen kromosomiin 14 molekyylihybridisaation avulla. Am J Hum Genet 1983;35:385-92.

21. Laurell CB, Eriksson S. Seerumin elektroforeettinen alfa-1-globuliinikuvio alfa-1-antitrypsiinin puutoksessa. Scand J Clin Lab Invest 1963;15:132-40.

22. Laurell CB, Kullander S, Thorell J. Yhdistetyn strogeeni-progestiiniehkäisyvalmisteen antamisen vaikutus yksittäisten plasman proteiinien tasoon. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:337-43.

23. Massi G, Chiarelli C. Alfa 1-antitrypsiini: molekyyli- ja pii-järjestelmä. Acta Paediatr 1994;393 Suppl:1-4.

26. Okayama H, Curiel DT, Brantly ML, Holmes MD, Crystal RG. Mutaatioiden nopea ei-radioaktiivinen osoittaminen ihmisen genomissa alleelispesifisellä monistuksella. J Lab Clin Med 1989;114:105-13.

28. Perlmutter DH. Alfa 1-antitrypsiinin puutoksen kliiniset ilmenemismuodot. Gastroenterol Clin North Am 1995;24:27-43.

30. Serra HG. Identificação molecular dos alelos S e Z do gene da alfa-1-antitripsina em um grupo de pacientes portadores de doença pulmonar crônica . Campinas, SP: Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas; 1998.

31. Silverman EK, Miletich JP, Pierce JA, Sherman LA, Endicott SK, Broze GJ, Campbell EJ. Alfa-1-antitrypsiinin puutos. Suuri esiintyvyys St. Louisin alueella suoralla väestöseulonnalla määritettynä. Am Rev Respir Dis 1989;140:961-6.

32. Sveger T. Maksasairaus alfa-1-antitrypsiinin puutoksessa havaittu 200 000 imeväisen seulonnalla. N Engl J Med 1976;294:1316-21.

33. Sveger T. Maksasairauden luonnollinen kulku alfa 1-antitrypsiinin puutoslapsilla. Acta Paediatr Scand 1988;77:847-51.

35. Talbot IC, Mowat AP. Maksasairaus pikkulapsuudessa. Histologiset piirteet ja suhde alfa 1-antitrypsiinifenotyyppiin. J Clin Pathol 1975;28:559-63.

36. Travis J, Salvesen GS. Ihmisen plasman proteinaasi-inhibiittorit. Annu Rev Biochem 1983;52:655-709.

37. Van Steenbergen W. Alfa 1-antitrypsiinin puutos: yleiskatsaus. Acta Clin Belg 1993;48(3):171-89.

38. Wewers MD, Casolaro MA, Sellers SE, Swayze SC, McPhaul KM, Wittes JT, Crystal RG. Empyseemaan liittyvä korvaushoidon puute. N Engl J Med 1987;316:1055-62.

Recebido em 3/11/1999.
Aprovado em 6/11/2000.

* Tutkimuksen suorittivat Campinasin valtionyliopiston (UNICAMP, Campinas, SP, Brasilia) lääketieteellisen tiedekunnan (FCM) pediatrian, lääketieteellisen genetiikan, anatomisen patologian ja kliinisen patologian laitokset.

1 Jatko-opiskelija. Pediatrian laitos, FCM/UNICAMP.

2 Apulaisprofessori. Kliinisen patologian laitos, FCM/UNICAMP.

3 Apulaisprofessori. Anatomisen patologian laitos, FCM/UNICAMP.

4 Genetiikan tohtori (biologian laitos), UNICAMP.

5 Apulaisprofessori. Lääketieteellisen genetiikan laitos, FCM/UNICAMP.

6 Apulaisprofessori. Lastenlääketieteen laitos, FCM/UNICAMP.