A Comparison of Immunohistochemistry and Western Blot

Toimittanut Sarah Moore, M.Sc.Arvostellut Michael Greenwood, M.Sc.

Immunohistokemia ja Western blotting toimivat molemmat hyödyntämällä periaatetta, joka perustuu siihen, miten vasta-aineet spesifisesti sitoutuvat biologisessa kudoksessa esiintyviin vasta-aineisiin.

Image Credit: Sinitar/.com

Immunohistokemia on immunovärjäystekniikoista yleisin. Se visualisoi kohdennettujen antigeenien läsnäolon kudosnäytteessä käyttämällä vasta-aineita, jotka kiinnittyvät antigeeneihin, joilla on katalyyttinen vaikutus ja jotka pilkkovat molekyylin tunnistettaviksi yhdisteiksi. Tämän vuorovaikutuksen visualisointi voidaan toteuttaa käyttämällä entsyymiä (tuottaa kromogeenisen signaalin) tai fluoroforia (tuottaa fluoresoivan signaalin).

Western blot toimii samalla periaatteella. Siitä kerrottiin ensimmäisen kerran jo 1970-luvulla, jolloin tutkijat käyttivät sitä ensimmäisen kerran menestyksekkäästi biologisessa kudoksessa esiintyvien eri proteiinien luokitteluun. Sittemmin tekniikassa on tapahtunut merkittävää kehitystä, joka on johtanut nykyaikaisen fluoresoivan, kolorimetrisen ja kemiluminesenssisen Western blot -tekniikan vakiintumiseen.

Kaikki Western blot -menetelmän versiot perustuvat antigeeni-vasta-ainekompleksin toimintaan, jonka avulla tunnistetaan näytteessä esiintyvät spesifiset valkuaisaineet, jotka osoitetaan joko kolorimetristen, kemiluminesensoivien tai fluoresoivia valkuaisaineita sisältävien molekyylien entsyymin ja substraatin välisillä reaktioilla. Näiden lähteiden tuottamasta valosta voidaan päätellä proteiinien läsnäolo ja pitoisuus näytteessä.

Tekniikoiden vertailu

Kahden menetelmän toiminta perustuu vasta-aineen ja antigeenin vuorovaikutuksen periaatteeseen, mutta niiden välillä on joitakin merkittäviä eroja. Seuraavassa eritellään ne vaihe vaiheelta.

Kummassakin tekniikassa näyte on ensinnäkin valmisteltava oikein. Valmistelu eroaa melko merkittävästi näiden kahden menetelmän välillä. Immunohistokemiaa varten kudosnäytteet viipaloidaan tai jätetään kokonaisiksi niiden koosta riippuen.

Näytteiden koon raja on yleensä 3 µm ja 5 µm välillä. Seuraavaksi näytteet upotetaan väliaineeseen, yleensä parafiiniin tai kryomediaan. Tämän jälkeen viipaleet asetetaan objektiolevyille ja dehydratoidaan käyttäen yhä vahvempia alkoholipesuja, ja lopuksi lisätään pesuainetta näytteen puhdistamiseksi, jolloin se on valmis tarkasteluun mikroskoopilla.

Toisaalta Western blot edellyttää, että näytteet erotetaan ensin toisistaan elektroforeesilla ja sen jälkeen immobilisoidaan blottikalvoon.

Näytteiden värjäysmenetelmä eroaa myös jonkin verran näiden kahden tekniikan välillä. Immunohistokemiassa lisätään joko polyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita. Nämä vasta-aineet luokitellaan joko ensisijaisiksi tai toissijaisiksi reagensseiksi, joista ensimmäiset on kasvatettu kohdeantigeenia vastaan ja ovat yleensä konjugoimattomia, jälkimmäiset on konjugoitu linkkerimolekyyliin, joka sitten rekrytoi reportterimolekyylejä.

Konjugoitua versiota käytetään suorassa värjäysmenetelmässä, jossa vasta-aine reagoi suoraan näytteessä olevan antigeenin kanssa, konjugoimatonta versiota käytetään epäsuorassa värjäysmenetelmässä, jossa leimaamaton vasta-aine sitoutuu kudoksessa olevaan kohdeantigeeniin, jolloin sekundäärinen vasta-aine reagoi primaarisen vasta-aineen kanssa.

Vertauksena Western blot -menetelmässä näytteeseen lisätään fluoresoivaa väriainetta, minkä jälkeen näytettä altistetaan sopivan aallonpituuden omaavalle valonlähteelle, joka kiihdyttää fluorofoorien molekyylejä.

Jonkin ajan kuluttua kiihdytetyt fluorofoorit lopulta vapauttavat valonlähteestä saamansa energian palatakseen perustilaansa. Tämä energian vapautuminen saa fluoroforit fluoresoimaan, jolloin ne säteilevät valonlähteen, jonka digitaalinen kuvantamislaite voi tallentaa.

Hyötyjen ja haittojen vertailu

Immunohistokemian tärkein etu on se, että menetelmän avulla tutkijat voivat havaita kohdeproteiinin tarkan sijainnin kudosnäytteessä. Tämä tärkein etu on johtanut siihen, että se on vakiinnuttanut asemansa neurotieteen alalla vankkana menetelmänä, jolla tutkitaan proteiinien ilmentymistä aivojen kohdepaikoissa.

Toisaalta menetelmällä on merkittävä haitta verrattuna Western blot -menetelmään. Tämä on se, että värjäytymiä ei tarkisteta molekyylipainoportaita vasten, kuten Western blot -menetelmässä, mikä tarkoittaa, että ei ole mitään keinoa todistaa, että immunohistokemiassa osoitettu värjäytyminen liittyy lopullisesti tiettyyn proteiiniin.

Immunohistokemian epäsuora menetelmä on tunnetusti erittäin herkkä, mutta suora menetelmä on tunnetusti päinvastainen, eikä sillä yleensä pystytä havaitsemaan kohdeantigeenien pieniä pitoisuuksia.

Westernblot-menetelmän etuna on se, että se on vakiinnuttanut asemansa luotettavana tekniikkana kvantitatiivisten tietojen keräämisessä. Sen merkittävin etu on kuitenkin se, että se on osoittautunut tehokkaaksi tuottamaan signaalin, joka on verrannollinen näytteessä olevan proteiinin määrään.

Yllättävän usein Western blot -menetelmä valitaan myös siksi, että sen avulla voidaan havaita useita kohdeproteiineja samanaikaisesti, mikä lyhentää huomattavasti testausaikaa sekä vähentää tarvittavien resurssien määrää.

Eroa käyttökohteissa

Kahden tekniikan käyttökohteiden välillä on paljon päällekkäisyyksiä, kun otetaan huomioon, että nämä tekniikat ovat keskenään samankaltaisia. Kaiken kaikkiaan immunohistokemiaan tukeudutaan kuitenkin enimmäkseen diagnostisena välineenä lukuisissa syövissä.

Menetelmää käytetään tunnistamaan tietyille kasvaimille ominaisia epänormaaleja soluja. Menetelmää käytetään myös laajalti sekä normaaleissa että sairaissa kudoksissa esiintyvien proteiinien ja biomarkkereiden tunnistamiseen ja paikantamiseen. Lopuksi sitä käytetään yleisesti myös lukuisten kudoksissa olevien tarttuvien organismien havaitsemiseen.

Vertauksena Western blot -menetelmää käytetään useimmiten autoimmuunisairauksien, allergioiden ja tartuntatautien havaitsemiseen. Sitä käytetään laajalti molekyylibiologian, biokemian ja solubiologian aloilla, ja sen merkittävimpiä sovelluksia käytetään HIV:n ja BSE:n diagnostisena välineenä.

Lisälukemista

• Kaikki immunohistokemian sisältö
• Immunohistokemian (IHC) kuvantamistekniikat
• Entsymaattinen immunohistokemia (IHC)
• Moniväri-immunohistokemian (IHC) tekniikat
• Miten immunokemia toimii?

Kirjoittanut

Sarah Moore

Opiskeltuaan ensin psykologiaa ja sen jälkeen neurotiedettä Sarah löysi nopeasti nautintonsa tutkimusten tekemisestä ja tutkimuspapereiden kirjoittamisesta; se kääntyi intohimoksi yhdistää ajatuksia ihmisiin kirjoittamalla.

Sitaatit