Una comparación entre la inmunohistoquímica y el Western Blot

Por Sarah Moore, M.Sc.Revisado por Michael Greenwood, M.Sc.

La inmunohistoquímica y el Western blot funcionan ambos explotando el principio de cómo los anticuerpos se unen específicamente a los antígenos presentes en el tejido biológico.

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La inmunohistoquímica es la más común de las técnicas de inmunotinción. Visualiza la presencia de antígenos objetivo dentro de una muestra de tejido mediante el uso de anticuerpos que se unen a los antígenos, teniendo un efecto catalítico, y dividiendo la molécula en compuestos identificables. La visualización de esta interacción puede lograrse utilizando una enzima (que produce una señal cromogénica) o un fluoróforo (que crea una señal fluorescente).

El Western blot funciona según el mismo principio. La primera vez que se informó de ello fue en la década de 1970, cuando los científicos la utilizaron por primera vez para clasificar con éxito las diferentes proteínas existentes en los tejidos biológicos. Desde entonces, se han realizado avances significativos en la tecnología, lo que ha llevado al establecimiento de la técnica moderna de Western blot fluorescente, colorimétrica y quimioluminiscente.

Todas las versiones del método Western blot se basan en el funcionamiento del complejo antígeno-anticuerpo para identificar las proteínas específicas presentes en una muestra, indicadas por las reacciones enzima-sustrato de las moléculas colorimétricas, quimioluminiscentes o fluorescentes. La luz producida por estas fuentes puede utilizarse para inferir la presencia y la concentración de las proteínas en una muestra.

Comparación de las técnicas

Aunque los dos métodos se basan en el principio de la interacción anticuerpo-antígeno, existen algunas diferencias importantes entre las dos técnicas. A continuación, desglosamos esto, paso a paso.

En primer lugar, para ambas técnicas, la muestra debe ser preparada correctamente. La preparación difiere bastante entre las dos. Para la inmunohistoquímica, las muestras de tejido se cortan o se dejan enteras, dependiendo de su tamaño.

El límite del tamaño de las muestras suele oscilar entre 3 µm y 5 µm. A continuación, las muestras se incrustan en un medio, normalmente cera de parafina o criomedia. A continuación, los cortes se colocan en portaobjetos y se deshidratan mediante lavados con alcohol de intensidad creciente, terminando finalmente con la adición de un detergente para limpiar la muestra, dejándola lista para ser observada al microscopio.

Por otro lado, el Western blot requiere que las muestras se separen primero por electroforesis y luego se inmovilicen en una membrana de blot.

El método de tinción de las muestras también es ligeramente diferente entre las dos técnicas. La inmunohistoquímica añade anticuerpos policlonales o monoclonales. Estos anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios; los primeros son los que se crían contra un antígeno diana y normalmente no están conjugados; los segundos están conjugados con una molécula enlazadora que luego recluta moléculas informadoras.

La versión conjugada se utiliza en un método de tinción directa, en el que el anticuerpo reacciona directamente con el antígeno de la muestra, la versión no conjugada se utiliza en un método de tinción indirecta en el que el anticuerpo no marcado se une al antígeno diana dentro del tejido, haciendo que un anticuerpo secundario reaccione con el anticuerpo primario.

En comparación, en el método Western blot se añade un colorante fluorescente a la muestra, seguido de la exposición a una fuente de luz de la longitud de onda adecuada para excitar las moléculas de los fluoróforos.

Después de un tiempo, los fluoróforos excitados acaban liberando la energía que han obtenido de la fuente de luz para volver a su estado básico. Esta liberación de energía es lo que hace que los fluoróforos sean fluorescentes, emitiendo una fuente de luz que puede ser captada por un generador de imágenes digitales.

Comparación de las ventajas e inconvenientes

La principal ventaja de la inmunohistoquímica es que el método permite a los investigadores detectar la ubicación exacta de una proteína objetivo dentro de una muestra de tejido. Esta ventaja principal ha hecho que se establezca en el campo de la neurociencia como un método sólido para investigar la expresión de proteínas en localizaciones cerebrales objetivo.

Por otro lado, el método tiene una desventaja importante cuando se compara con el método Western blot. Se trata del hecho de que las tinciones no se cotejan con una escala de peso molecular, como ocurre en el Western blot, lo que significa que no hay forma de demostrar que la tinción mostrada en la inmunohistoquímica está relacionada de forma concluyente con una proteína específica.

El método indirecto de inmunohistoquímica es reconocido por ser altamente sensible, sin embargo, el método directo es conocido por ser lo contrario, y es generalmente incapaz de detectar pequeñas concentraciones de antígenos objetivo.

El método Western blot tiene la ventaja de que se ha establecido como una técnica fiable para recoger datos cuantitativos. Sin embargo, su ventaja más destacada es que ha demostrado ser eficaz en la generación de una señal que es proporcional a la cantidad de la proteína que existe en la muestra.

Además, el Western blot se elige a menudo por su capacidad para detectar numerosas proteínas diana simultáneamente, lo que tiene el efecto de reducir significativamente el tiempo de las pruebas, así como el número de recursos necesarios.

Diferencia en las aplicaciones

Hay una gran superposición en las aplicaciones de las dos técnicas, dado que son tan similares. Sin embargo, en general, se confía en la inmunohistoquímica como herramienta de diagnóstico para numerosos cánceres.

El método se utiliza para identificar células anormales que son características de ciertos tumores. El método también se utiliza ampliamente para identificar y localizar proteínas y biomarcadores que se encuentran tanto en los tejidos normales como en los enfermos. Por último, también se suele utilizar para detectar numerosos organismos infecciosos dentro de los tejidos.

En comparación, el Western blot se utiliza principalmente para la detección de enfermedades autoinmunes, alergias y enfermedades infecciosas. Se utiliza ampliamente en los campos de la biología molecular, la bioquímica y la biología celular, y sus aplicaciones más notables se utilizan como herramienta de diagnóstico del VIH y la EEB.

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Escrito por

Sarah Moore

Después de estudiar Psicología y luego Neurociencia, Sarah encontró rápidamente su disfrute por la investigación y la escritura de trabajos de investigación; convirtiéndose en una pasión para conectar las ideas con la gente a través de la escritura.

Citaciones