Resultados y discusión
Estructura general del dominio TE. Aunque la estructura del dominio TE aislado que se resolvió representa dos moléculas independientes (1 y 2) en la unidad asimétrica (Tabla 1), el dominio se purificó y fue totalmente activo como monómero (Z.G. y B.C., datos no publicados). El FAS humano nativo está dispuesto como un homodímero antiparalelo cabeza-cola (1) como se ha visualizado recientemente en los mapas de criomicroscopía electrónica (cryo-EM) (31). Esta disposición situaría los dos dominios TE de los monómeros del FAS en extremos opuestos entre sí, lo que no daría relevancia funcional a la formación de un dímero. Por estas razones, el dímero es un artefacto de la cristalización. La estructura de la molécula 1 se considera en lo sucesivo como representativa de la estructura.
El dominio TE del FAS humano comprende dos subdominios (A y B) (Fig. 1). El subdominio A, de mayor tamaño (≈23 kDa), está formado por dos segmentos no contiguos de los extremos terminales amino (o N) y carboxilo (o C) (Figs. 1, 2, 3). El segmento intermedio está consignado al subdominio B, más pequeño (≈9-kDa). El subdominio A tiene un pliegue general α/β, mientras que el subdominio B tiene un motivo totalmente α-helicoidal. La estructura completa está formada por nueve α-hélices y ocho hebras β (Figs. 1 y 2). La mayor parte de la estructura completa del dominio TE pudo ajustarse a la densidad electrónica, excepto los tres segmentos y un residuo de glicina mostrados en las Figs. 1, 2 y 3, con densidad ausente o débil, lo que indica su alta movilidad. Todos los segmentos desordenados están en regiones expuestas al disolvente y no están cerca de estar implicados en los contactos cristalinos.
Los tres residuos catalíticos de la TE FAS humana (Ser-2308, His-2481 y Asp-2338) están unidos entre sí y a los residuos vecinos por una extensa red de enlaces de hidrógeno (Fig. 4). El grupo hidroxilo de Ser-2308 está involucrado en un enlace de hidrógeno cooperativo, aceptando de la columna vertebral amida adyacente de Tyr-2309 y donando a Nε2 de His-2481. Esto, a su vez, facilitaría la activación de Ser-2308 como nucleófilo y ayudaría a estabilizar el intermedio tetraédrico de oxianiones que se espera que se forme durante la reacción catalítica de TE, como se observa en las serina hidrolasas. El residuo His-2481 (Nε2) a su vez está unido por hidrógeno al Asp-2338 (Oδ2). El Asp-2338 (átomo Oδ1) realiza enlaces de hidrógeno adicionales tanto con la amida de la columna vertebral de Ala-2448 como con el grupo hidroxilo de Tyr-2462. Tyr-2462 es completamente invariable, mientras que Ala-2448 se conserva parcialmente desde los insectos hasta los mamíferos (Fig. 3). Por lo tanto, la interacción entre estos residuos y el residuo de aspartato catalítico parece ser importante para mantener el Asp-2338 fijo en su posición particular, lo que significa además el importante papel que desempeña este residuo. La extensa red de enlaces de hidrógeno en el sitio catalítico mantiene a la enzima preparada para la acción orientando y colocando los residuos catalíticos en sus posiciones requeridas, de forma muy parecida a los de las serina hidrolasas (40).
Sitio de unión de la cadena de palmitoilo y especificidad de la longitud de la cadena. Para comprender el mecanismo por el que el dominio TE de FAS regula la especificidad de longitud de cadena, analizamos la estructura del TE para detectar la presencia de un surco cerca del centro catalítico que pudiera alojar sustratos de cadena de acilo larga. La presencia de un solo surco es evidente, el cual está localizado en la interfaz entre los subdominios A y B (Fig. 5). El análisis mediante proshape (véase Materiales y Métodos) confirmó la presencia del surco con un volumen de 186,9 Å3 y una superficie de 140 Å2, cuyo extremo distal forma un bolsillo (Fig. 5). El surco está cerca del extremo amino del dominio TE, que está unido al dominio ACP del FAS que sostiene las cadenas de acilo en crecimiento para su exploración y liberación por el dominio TE tras alcanzar la longitud óptima de la cadena de ácidos grasos de 16 carbonos. La mayoría de los residuos que recubren el surco proceden de la hélice ampifílica α8 del subdominio B. Otros residuos que contribuyen a él proceden de la hélice α5 del subdominio B, de la hélice N-terminal α1 del subdominio A y del bucle entre β2 y α2 del subdominio A. Los residuos que recubren el surco, que son en su mayoría de naturaleza hidrofóbica, consisten en Phe-2418, Ala-2419, Ser-2422, Phe-2423 y Lys-2426 de la hélice α8, Phe-2370 y Phe-2371 de la hélice α5, Leu-2222, Leu-2223 y Val-2224 de la hélice α1, e Ile-2250 y Glu-2251 del bucle entre β2 y α2 (Fig. 5A ). De estos residuos, Ile-2250, Glu-2251 y Lys-2426 son invariables entre especies, mientras que Val-2224, Phe-2371, Ala-2419 y Phe-2423 se conservan en su mayoría (Fig. 3). El resto de los residuos están completamente conservados en los mamíferos (Fig. 3). Todas las observaciones anteriores en conjunto sugieren que la interfaz entre los dos subdominios es una excelente región de unión de cadenas de ácidos grasos. Se llevaron a cabo dos experimentos para dar credibilidad a esta sugerencia y obtener información sobre la selectividad de la cadena de acilo graso.
Sitio de unión de lípidos. (A) Vista estereoscópica del surco de unión del palmitoilo candidato para los primeros 11-12 carbonos y el bolsillo para los últimos 5-4 carbonos. El inhibidor de hexadecilsulfonilo se representa como un modelo de relleno de espacio de Corey-Pauling-Koltun (C, amarillo; O, rojo; S, verde). Las cadenas laterales que recubren el surco se muestran como figuras de bolas y palos (C, amarillo; O, rojo; N, azul). Las cadenas laterales que conforman el sitio activo también se muestran como figuras de bola y palo con un esquema de colores similar al de los residuos. El mapa de la superficie del surco se muestra en malla metálica verde. Los residuos que componen el surco están etiquetados excepto Ile-2250, que no puede verse porque cae por debajo del inhibidor. Los 11-12 átomos de carbono iniciales del grupo sulfonilo están expuestos al disolvente con los átomos de carbono 11 y 12 en la boca del bolsillo. (B) Una vista diferente de la ranura y el bolsillo. Las flechas denotan las rotaciones al pasar de la orientación de la vista en A a B. Esta vista muestra que la mayor parte de la cadena de acilo graso del inhibidor de hexadecilo está expuesta al disolvente.
En primer lugar, demostramos mediante mutagénesis dirigida al sitio que las sustituciones de varios de los residuos que recubren el surco y el bolsillo del dominio TE reducían la actividad TE, aunque en distintos grados (Tabla 2).
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En segundo lugar, pudimos modelar la unión de un inhibidor que contiene cadena de palmitoilo C16, el f luoruro de hexadecilo sulfonilo (HDSF), en el surco. El modelado fue guiado por los datos de la estructura cristalina de la proteína palmitoyl TE 1 (PPT1) con hexadecil sulfonato (HDS) unido covalentemente (código PDB ID 1exw; ref. 41) y aumentado por la minimización de energía en cns. Al igual que TE, el sitio catalítico de PPT1 contiene una tríada catalítica conservada de serina, histidina y aspartato. La estructura del complejo PPT1-HDS mostró la formación del enlace covalente entre el átomo de azufre del HDS y el átomo de oxígeno de la serina catalítica y la presencia de la cadena de acilo graso en un largo surco superficial mayormente hidrofóbico de la proteína (41). El modelo del HDS unido covalentemente en la estructura TE (mostrado en la Fig. 5) reveló varias características de la unión del ligando con importantes implicaciones funcionales y bioquímicas. El ajuste del HDS no causó ningún reordenamiento importante de los residuos en el sitio de unión. La cadena de palmitoilo se dobla bruscamente con respecto al grupo sulfonato de forma similar a la observada en la estructura de la PPT1 unida. La cadena de palmitoilo de 16 átomos de carbono encaja bien dentro del surco con los primeros ≈12 átomos de carbono expuestos al disolvente y los restantes ≈4 átomos de carbono insertados y mantenidos en el bolsillo distal. Este ajuste es totalmente coherente con la observación de que el FAS TE de los mamíferos cataliza la formación de ácido palmítico como su principal producto (20). La presencia de los últimos ≈4 átomos de carbono en el bolsillo ayuda a sujetar la cadena de ácido graso en su lugar para la hidrólisis del palmitoil sustrato. La naturaleza del sitio de unión, que combina un surco expuesto con un bolsillo cerrado, es única y está diseñada para la especificidad de esta ET. El hallazgo de que el dominio TE de los FAS de mamíferos no muestra una actividad significativa hacia las cadenas de acilo graso de longitudes inferiores a 14 átomos de carbono (20) puede explicarse por la unión no productiva debido a la falta de sujeción y a la mayor movilidad resultante de las cadenas más cortas expuestas. Los últimos ≈4 átomos de carbono de la cadena de palmitoilo ocupan parcialmente el bolsillo distal, dejando espacio suficiente para acomodar sólo 2 átomos de carbono adicionales. Este resultado es coherente con la drástica pérdida de actividad observada con sustratos modelo de más de 18 átomos de carbono (20). No está claro si los últimos átomos de carbono ≈4 y ≈6 de las cadenas de acilo graso C16 y C18, respectivamente, se insertarán en un bolsillo preformado entre los dos subdominios, como se ve en la estructura de la forma no unida, o se unirán inicialmente a una forma abierta del dominio que posteriormente sufrirá un movimiento de flexión de bisagra entre los subdominios para encerrar los átomos de carbono terminales de las cadenas de acilo graso y crear la configuración productiva de la región del sitio activo.
Se hicieron esfuerzos considerables para cristalizar la ET con varios análogos de ácidos grasos de cadena larga (por ejemplo, palmitoil-CoA, miristoil-CoA, estearoil-CoA, ácido palmítico, fluoruro de hexadecilsulfonilo y ácido palmítico), pero no se encontraron estructuras complejas estables de larga duración. La mayoría de los complejos, como se demostró mediante ensayos independientes de actividad enzimática o de unión radiactiva en solución, se disociaron en un plazo de entre 5 minutos y 1 hora, lo que los hizo inadecuados para los ensayos de cristalización o remojo de cristales.
Ajuste por crio-EM de la estructura de TE. Aunque se ha descrito la estructura de reconstrucción por crio-EM de 20-Å del dímero FAS humano (31), no había ninguna indicación de la polaridad N- a C-terminal de la subunidad FAS, salvo una indicación previa a partir del etiquetado con anticuerpos de que el dominio TE de FAS estaba situado en uno de los extremos de toda la estructura (42). Intentamos una evaluación preliminar de la polaridad acoplando manualmente la estructura del dominio TE del FAS humano más pequeña (32 kDa), que ocupa el extremo C-terminal de la subunidad FAS, y la más grande (42 kDa) de E. coli β-cetoacil sintasa I (o KSI) (código PDB ID 1ek4) (43), que es un homólogo cercano del dominio KS N-terminal del FAS de mamíferos, en cada extremo de la unidad de monómero designado cabeza y pie de la densidad de masa crio-EM (Fig. 6). La estructura TE encaja bien en el extremo de la subestructura designada pie, mientras que el KSI encaja mejor en el extremo de la subestructura designada cabeza (Fig. 6). En el dímero FAS, el dominio ACP interactúa tanto con el dominio TE del mismo monómero como con el dominio cetoacil sintasa en el monómero opuesto, dando lugar a la formación de dos centros activos en los dos extremos del dímero. La orientación del dominio TE y del dominio KS homólogo para el mejor ajuste en el pie y la cabeza, respectivamente, se acomodó tanto al espacio como a la interacción funcional de la molécula de ACP con ambas proteínas. Cuando se cambiaron las estructuras el ajuste fue mucho más pobre, con algunas partes de KSI cayendo fuera de la densidad y un mayor volumen de densidad no contabilizado en el ajuste de TE (Fig. 6).
Ajuste preliminar de TE (trazo verde de la espina dorsal) y KSI (trazo granate) en la densidad de masa de 20-Å de resolución de cryo-EM. Las subestructuras vistas desde la densidad se designan como Cabeza, Torso y Pie. La traza TE se ajusta mejor en la subestructura designada Pie, mientras que el ajuste de la traza KSI de la columna vertebral es mejor en la subestructura designada Cabeza. El mejor ajuste para KSI y TE está marcado con un círculo rojo. Las trazas de la columna vertebral de TE y KSI en la parte inferior de la densidad de masa muestran ajustes menos satisfactorios en la cabeza y el pie, respectivamente. Basándose en experimentos previos de digestión proteolítica del FAS intacto, se identificaron tres dominios: el dominio I, que comprende los centros enzimáticos KS-AT/MT-DH y la región enlazadora; el dominio II, que comprende la región ER-KR-ACP; y el dominio III, que se asigna al TE (1, 2). Las subestructuras Cabeza y Torso, que están esencialmente cohesionadas, podrían corresponder al dominio I y a partes del dominio II, y el Pie podría representar el resto del dominio II y el dominio III.
Conclusiones. Las principales conclusiones que se pueden extraer de la estructura cristalina del dominio TE del FAS humano son las siguientes. (i) El TE está compuesto por dos subdominios que difieren en tamaño y motivos de plegado. (ii) El subdominio A, más grande, presenta un motivo α/β, mientras que el subdominio B, más pequeño, es totalmente helicoidal. (iii) El subdominio A aporta la tríada catalítica de residuos Ser, Asp e His. (iv) El largo surco con un bolsillo distal entre el subdominio B y partes del subdominio A constituye el sitio de unión de la cadena de acilo graso. La geometría y la naturaleza de este sitio son consistentes con la alta especificidad de la ET hacia sustratos de acilo graso C16 a C18. El surco actúa como una regla que mide la longitud correcta del sustrato. (v) El ajuste preliminar de la TE en la estructura crio-EM del FAS humano intacto sugiere una polaridad plausible del extremo N al C de las subunidades. Sin embargo, se necesita un mapa crio-EM de mayor resolución para verificar más el ajuste y un análisis en profundidad de la función del FAS.
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