La prueba oxidativa-fermentativa (OF) fue desarrollada por Hugh y Leifson en 1953. Desarrollaron el medio OF para diferenciar entre las bacterias oxidativas (que producen ácido a partir de los carbohidratos sólo en condiciones aeróbicas) y las bacterias fermentativas (que producen ácido tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas).
Los microorganismos sacarolíticos degradan la glucosa de forma fermentativa u oxidativa. Los productos finales de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes que pueden detectarse en un medio de prueba de fermentación convencional. Sin embargo, los ácidos formados en la degradación oxidativa de la glucosa son extremadamente débiles y menores, y se requiere el medio de fermentación de oxidación más sensible del medio OF de Hugh y Leifson para la detección. El medio se hizo aumentando la cantidad de glucosa por encima de la encontrada en el medio utilizado para detectar la fermentación y disminuyendo la cantidad de peptona.
El medio OF de Hugh y Leifson difiere de los medios de fermentación de carbohidratos de la siguiente manera:
- La concentración de agar se disminuye al 2% desde el 3%, haciendo que tenga una consistencia semisólida (Esto ayuda a la determinación de la motilidad del organismo).
- La concentración de peptona se disminuye del 11% al 2%. (Disminuyendo la cantidad de producto alcalino producido por el metabolismo de la peptona; reduciendo así el efecto neutralizador de estos productos).
- La concentración de carbohidratos se incrementa del 0,5% al 1.0% (El aumento de la concentración de glucosa en el medio potencia la producción de estos ácidos débiles hasta un nivel que puede ser detectado por el indicador azul de bromo.)
Principio:
La prueba oxidativa-fermentativa determina si ciertos bacilos gramnegativos metabolizan la glucosa por fermentación o por respiración aeróbica (oxidativamente). Durante el proceso anaeróbico de fermentación, el piruvato se convierte en una variedad de ácidos mixtos dependiendo del tipo de fermentación. La alta concentración de ácido producida durante la fermentación hará que el indicador azul de bromo en medios OF pase de verde a amarillo en presencia o ausencia de oxígeno.
Ciertas bacterias gramnegativas no fermentadoras metabolizan la glucosa mediante respiración aeróbica y, por tanto, sólo producen una pequeña cantidad de ácidos débiles durante la glucólisis y el ciclo de Krebs. La disminución de la cantidad de peptona y el aumento de la cantidad de glucosa facilita la detección de los ácidos débiles así producidos. Se añade tampón de fosfato dipotásico para favorecer aún más la detección de los ácidos.
Usos:
La prueba OF se utiliza para determinar si las bacterias gramnegativas metabolizan los hidratos de carbono de forma oxidativa, por fermentación, o no son sacrolíticas (no tienen capacidad para utilizar los hidratos de carbono del medio).
Medio:
Medio basal OF de Hugh y Leifson; los componentes son los siguientes:
- Cloruro de sodio : 5,0 g
- Fosfato de di-potasio : 0,3 g
- Peptona : 2.0 g
- Azul de bromo: 0,03 g
- Agar: 3,0 g
- Glucosa: 10 g
- Agua: 1000 ml
El pH debe ajustarse a 7,1 antes de la autoclavación. Después de esterilizar el medio en autoclave a 121°C durante 15 minutos, se añade asépticamente al medio una solución esterilizada por filtro de una solución de hidratos de carbono al 10% hasta una concentración final del 1%.
Procedimiento
- Inocular dos tubos de medio de ensayo OF con el organismo de ensayo utilizando un alambre recto pinchando «hasta la mitad del fondo» del tubo.
- Cubrir un tubo de cada par con una capa de 1 cm de aceite mineral estéril o parafina líquida (crea una condición anaeróbica en el tubo impidiendo la difusión de oxígeno), dejando el otro tubo abierto al aire.
- Incubrir ambos tubos a 35°C durante 48 horas (Las bacterias de crecimiento lento pueden tardar de 3 a 4 días antes de poder observar los resultados)
Interpretación
La producción de ácido se detecta en el medio por la aparición de un color amarillo. En el caso de los organismos oxidativos; la producción de color puede notarse primero cerca de la superficie del medio.
Los siguientes son los patrones de reacción:
- Resultado fermentativo: Producción de ácido en ambos tubos (abiertos y tapados). El ácido producido hace que el indicador de pH, el azul de bromo, pase de verde a amarillo. por ejemplo, Escherichia coli
- Resultado oxidativo: La producción de ácido en el tubo abierto (aeróbico) y no en el tubo cubierto de aceite (anaeróbico) indica un resultado oxidativo. Las bacterias no fermentadoras que metabolizan la glucosa a través del metabolismo oxidativo dan un resultado oxidativo. por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa
- No sacarolítica (resultado OF negativo): Las bacterias no sacarolíticas dan un resultado OF negativo. El resultado negativo se indica por la ausencia de cambio de color en el tubo cubierto de aceite y, en algunos casos, por un aumento del pH (pH 7,6) que hace que el azul de bromo pase de verde a azul en la parte superior del tubo abierto. El aumento del pH se debe a la producción de aminas por parte de las bacterias que descomponen la peptona (proteína) del medio.
Por ejemplo, Alcaligenes faecalis.
Control de calidad
- Fermentador de glucosa: Escherichia coli
- Oxidante de glucosa: Pseudomonas aeruginosa
- No sacarolítica: Moraxella species
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