Resultados y discusión
La activación constitutiva del factor de transcripción NF-κB se considera esencial para la transformación de las células B por la proteína de fusión API2-MALT1 de los linfomas MALT con una translocación t(11;18) . La sobreexpresión transitoria de API2-MALT1 en células 293T resulta en la activación robusta de un gen reportero de luciferasa NF-κB , proporcionando así un sistema modelo útil para estudiar los mecanismos por los que API2-MALT1 señala a NF-κB. Para controlar la eficacia de la transfección, coexpresamos pEGFP-N2 (Clontech) en varios experimentos. Para nuestra sorpresa, observamos que EGFP inhibía la activación de NF-κB inducida por API2-MALT1 de forma dependiente de la dosis (Fig 1A). En cambio, EGFP no afectó a la activación del reportero inducida por la expresión de las subunidades p50/p65 de NF-κB (Fig 1B), lo que sugiere una interferencia con la cascada de señalización de NF-κB activada por API2-MALT1 aguas arriba de NF-κB.
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(A) La activación de un reportero de luciferasa de NF-κB por una proteína de fusión API2-MALT1 marcada con Flag es inhibida por EGFP de forma dependiente de la dosis.
(B) La EGFP no bloquea la actividad de luciferasa dependiente de NF-κB inducida por la expresión de las subunidades p50/p65 de NF-κB (C) La activación de un reportero de luciferasa de NF-κB por la proteína de fusión Flag-API2-MALT1 es inhibida por EGFP mutada para el motivo de unión a TRAF6 (D) EGFP pero no pmaxGFP previene la activación inducida por TNF-α del reportero de luciferasa NF-κB y la fosforilación de IκB-α y JUN en células 293T.
EGFP no aumenta los niveles de HSP70 ni induce HSP70B′ en células 293T.
Las intensidades de fluorescencia (Ex485/Em520nm) para EGFP y pmaxGFP fueron ambas ∼100 veces superiores al fondo. (E) Las proteínas de fusión EGFP N- y/o C-terminal (para API2, CHIC2, NXF5a, NXF1, MALT1, Actina, Rab5, proteína de unión a Syndecan 2 (SDCBP2) o β-Tubulina) y EGFP con una señal de localización nuclear (NLS) o un sitio de farnisilación (pEGFP-F) reducen la actividad reportera de la luciferasa NF-κB inducida por TNF-α en células 293T. En la parte inferior: En los seres humanos, la HSP70 se expresa constitutivamente en condiciones normales, pero la Hsp70B′ sólo se induce en respuesta al estrés.
No hay expresión basal de la Hsp70B′.
Como control positivo de la expresión de HSP70B′, las células 293T (carril 2) se sometieron a un choque térmico a 44°C durante dos horas (carril 3) y se dejaron recuperar a 37°C durante 5 (carril 4) o 18 (carril 5) horas antes de la cosecha. La actividad de luciferasa dependiente de NF-κB se representa para cada experimento como la inducción del pliegue de las células transfectadas con el vector y se representa gráficamente como la media y la desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
Todos los estándares de peso molecular están en kDa.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g001
MALT1 es un componente de señalización esencial de la vía del antígeno-receptor hacia NF-κB , . Se cree que BCL10 media la oligomerización de MALT1, lo que permite la formación de un complejo con TRAF6. La oligomerización de TRAF6 provoca la actividad de ubiquitina ligasa E3 de su dominio RING, lo que da lugar a la modificación de IKKγ (NEMO) mediante cadenas de poliubiquitina ligadas a Lys63. Esto facilita entonces la interacción de IKKγ con la quinasa activadora de TGFβ 1 (TAK1), que activa completamente el complejo quinasa IκB (IKK) a través de la fosforilación de IKKβ , lo que conduce a la activación de NF-κB. Del mismo modo, la proteína de fusión API2-MALT1 activa el NF-κB a través de la poliubiquitinación de IKKγ , mediada por TRAF6. La interacción de TRAF6 con el carboxi-terminal de MALT1 se produce a través de dos posibles motivos de unión de TRAF6 (PxExxAr/Ac con Ar/Ac para un residuo aromático o ácido . La inspección de la secuencia de EGFP reveló la presencia de un consenso de unión a TRAF6 (PNEKRD, AA 212-217). La estructura cristalina de EGFP muestra que el motivo PNEKRD está expuesto en un bucle entre dos láminas beta, lo que sugiere su accesibilidad y un papel de EGFP como regulador negativo mediante el secuestro de TRAF6. Sin embargo, los experimentos de co-IP no pudieron demostrar una interacción entre EGFP y TRAF6 (datos no mostrados) y los mutantes para el consenso de unión a TRAF6 bloquearon la activación de NF-κB por API2-MALT1 con la misma eficacia que EGFP (Fig 1C).
Para investigar si el efecto se limitaba a API2-MALT1, analizamos la activación de NF-κB inducida por TNF-α en células 293T que expresaban EGFP. De nuevo, la EGFP redujo la señalización de NF-κB, tal y como demostró la menor actividad del reportero y la menor fosforilación del inhibidor de NF-κB, IκB-α (Fig 1D). A continuación evaluamos si las proteínas de fusión EGFP podrían tener el mismo efecto. Ambas fusiones EGFP N- y C-terminal bloquearon la activación del NF-κB inducida por API2-MALT1 (datos no mostrados) y TNFα (Fig 1E). Además de activar la vía NF-κB, el tratamiento con TNF-α también desencadena la señalización de JNK. La fosforilación de JUN, indicativa de la activación de la señalización de JNK, se reduce con EGFP también tras el tratamiento con TNF-α (Fig 1D).
Se ha informado de que la visualización prolongada de las células que expresan GFP induce la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que puede dar lugar a cambios fisiológicos y, finalmente, a la muerte celular . Curiosamente, ambos mutantes de EGFP para el consenso de unión a TRAF6 habían perdido su fluorescencia verde pero inhibían eficientemente la señalización de NF-κB (Fig 1C). Además, la pmaxGFP (Amaxa Biosystems), una proteína fluorescente estructuralmente diferente, no afectó a la activación de NF-κB y JNK tras el tratamiento con TNF-α (Fig 1D), lo que sugiere que la inhibición no fue resultado de la fototoxicidad asociada a los radicales libres. Otro estudio indicó que altos niveles de EGFP pueden inducir la proteína de choque térmico 70 (HSP70), que es capaz de inhibir la activación de NF-κB a través de su interacción con IKKγ y TRAF6 . Sin embargo, la inducción de HSP70 estaba restringida a las células endoteliales y no observamos un aumento de los niveles de HSP70 o la inducción de HSP70B′ en las células 293T que expresaban EGFP (Fig 1D-E).
La activación de NF-κB por la expresión de API2-MALT1 o tras el tratamiento con TNF-α está asociada a la modificación de IKKγ con poliubiquitina ligada a Lys63 por TRAF6 o TRAF2 respectivamente , . Además, la señalización de JNK inducida por TNF-α requiere la auto-ubiquitinación de TRAF2 . Para evaluar un posible efecto de EGFP en la actividad ubiquitina ligasa RING E3 de TRAF6 o TRAF2, monitorizamos la ubiquitinación a través de un mutante de ubiquitina marcado con HA con sólo Lys63 disponible para la polimerización (HA-Ub-K63). La expresión de API2-MALT1 o la estimulación con TNF-α aumentó el nivel de proteínas poliubiquitadas en las células 293T y se asoció con una mayor poliubiquitinación de IKKγ en los inmunoprecipitados, y ambos procesos fueron bloqueados por EGFP (Fig 2A, carriles 1,2,5,6). Además, la EGFP redujo el nivel basal de poliubiquitinación ligada a K63 en las células 293T (Fig 2A, carriles 3 y 4). De forma similar, la expresión de API2-MALT1 o el tratamiento con TNFα estimula el ensamblaje de la cadena de ubiquitina ligada a K48, que de nuevo es bloqueado por EGFP y su homólogo estructural dsRed (Clontech) pero no por pmaxGFP (Fig 2B).
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(A) Las células 293T transfectadas con las construcciones indicadas y tratadas durante 4 horas con 20 ng/ml de TNF-α (carril 5 y 6) se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-Flag (API2-MALT1), anti-HA (HA-Ub-K63) y anti-EGFP (panel izquierdo) o los inmunoprecipitados anti-IKKγ se sometieron a inmunotransferencia con anti-Flag (IKKγ) o anti-HA (ubiquitina) (panel derecho).
(B) La EGFP afecta a la poliubiquitinación ligada a K48.
Las células 293T se transfectaron con una construcción de ubiquitina con sólo Lys48 disponible para la polimerización (HA-Ub-K48), se trataron durante 4 horas con 20 ng/ml de TNF-α o se dejaron sin tratar y los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-HA (Ub-K48) y antiEGFP.
Las intensidades de fluorescencia (Excitación 485/Emisión 520 nm) para EGFP y pmaxGFP fueron comparables (∼100 veces más altas que los valores de fondo), la expresión de pDs-Red se confirmó mediante microscopía de fluorescencia.
(C) La EGFP estabiliza la API2-Myc exógena en las células 293T a través de la reducción de su auto-ubiquitinación ligada a Lys48 y la degradación proteasomal.
(D) La expresión estable de EGFP en la línea celular de carcinoma de células de Merkel MCC14.2 reduce la poliubiquitinación y aumenta los niveles de expresión endógena de p53.
Se indican la relación media y la desviación estándar de las señales de p53 con respecto a la actina (tres experimentos independientes), (Ub)n : proteínas poliubiquitadas.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g002
Para investigar si la EGFP afecta exclusivamente a la ubiquitinación por parte de las proteínas TRAF, evaluamos API2, una ubiquitina ligasa RING E3 que se desestabiliza a sí misma a través de la auto-ubiquitinación ligada a Lys48 . La coexpresión de EGFP inhibió la poliubiquitinación inducida por API2 en las células 293T, dando lugar a un aumento de los niveles de expresión de API2 (Fig 2C). También se observó una reducción de los niveles de ubiquitinación en estado estacionario en las células MCC14.2 con expresión estable de EGFP. Como consecuencia, los niveles basales de p53 endógeno, que están estrechamente regulados a través de la ubiquitinación ligada a Lys48 por MDM2, están ligeramente aumentados en las células que expresan EGFP (Fig 2D).
A continuación examinamos si EGFP afecta a la ubiquitinación in vivo. Los niveles basales de poliubiquitinación se redujeron en los linfocitos esplénicos de los ratones transgénicos con EGFP, lo que se asoció a una menor fosforilación de IκB-α tras la estimulación con antígenos en comparación con los ratones de control, lo que indica que EGFP reduce la activación de NF-κB inducida por el receptor de células B (Fig 3A-B). Los ratones transgénicos API2-MALT1 tienen un déficit de células B B220+/CD40+ en su médula ósea ya que la activación de NF-κB mediada por API2-MALT1 acelera su maduración a células B naïve . Cuando estos ratones transgénicos API2-MALT1 se cruzaron con ratones EGFP, el déficit de células B B220+/CD40+ en la médula ósea de los ratones transgénicos dobles EGFP/API2-MALT1 (Fig. 3C) se restableció, lo que apoya aún más un impacto en la ubiquitinación y la señalización NF-κB in vivo. Del mismo modo, la poliubiquitinación se redujo en las células del hígado de los ratones EGFP y se asoció con la estabilización de p53, como lo demuestra el aumento de su nivel de expresión (Fig 3A, D). El principal gen diana de p53 tras el daño al ADN inducido por la γ-irradiación en el hígado es p21, que es necesario para la detención del ciclo celular y la reparación del ADN. En consecuencia, el daño al ADN inducido por la γ-irradiación no sólo causó una mayor respuesta de p53 en los ratones EGFP, sino que también la inducción de p21 fue ligeramente mayor (Fig. 3D). Por último, se realizaron experimentos in vitro para evaluar si la EGFP afecta directamente al ensamblaje de la cadena de ubiquitina; sin embargo, la EGFP recombinante no afectó a la poliubiquitinación de un sustrato de control (Fig 3E), lo que sugiere un efecto de la EGFP sobre la ubiquitinación que depende del contexto celular.
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(A) Western blots de extractos de bazo e hígado de ratones FVB de tipo salvaje (wt) y transgénicos con EGFP detectados con anticuerpos contra Ubiquitina, EGFP y actina (control de carga).
(B) La EGFP reduce la fosforilación de IκB-α en linfocitos B estimulados con anti-IgM/anti-CD40 purificados a partir de ratones con EGFP.
Los experimentos se realizaron por triplicado, se muestra una imagen representativa de un experimento.
Se indican la media y las desviaciones estándar de las proporciones de IκB-α-P con respecto a las células no estimuladas.
(C) El déficit de células B B220+/CD40+ en la médula ósea de los ratones API2-MALT1 se restablece en los ratones transgénicos dobles EGFP/API2-MALT1.
Se muestran los experimentos realizados por triplicado, la media y las desviaciones estándar. eMalt1: Malt1 endógeno, banda específica de *a (D) Los ratones EGFP muestran un aumento de los niveles de p53 en el hígado y tienen una mayor respuesta de p53/p21 ante el daño del ADN inducido por la γ-irradiación.
Se indican la media y las desviaciones estándar de las relaciones entre las señales de p53/p21 y actina en relación con la muestra 1.
(E) La EGFP recombinante (rEGFP) no impide la poliubiquitinación de un sustrato de biotina-lisozima in vitro. (Ub)n: proteínas poliubiquitinadas.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0000054.g003
En conclusión, nuestros datos indican que las proteínas de fusión EGFP y EGFP afectan a procesos dependientes de la ubiquitina ligasa RING E3 como la señalización NF-κB y JNK o la homeostasis de p53 en líneas celulares y en ratones. El NF-κB desempeña un papel central en la regulación de diversos procesos biológicos, como la inmunidad innata y adaptativa, el desarrollo, el crecimiento celular y la supervivencia. Las señales de pro-supervivencia resultan de la elevada expresión de inhibidores de la apoptosis, como la leucemia/linfoma de células B-XL. Por lo tanto, el aumento de la apoptosis inducido por la EGFP en las células o en la corteza motora y el estriado del cerebro de los ratones podría estar relacionado con la reducción de la actividad del NF-κB debido a una poliubiquitinación defectuosa y a la activación/degradación de sus reguladores aguas arriba. También se postula que la ubiquitinación defectuosa es la causa de la distrofia muscular de cinturas, que se asocia a mutaciones en Trim32, una ubiquitina ligasa para la actina. Dado que se ha demostrado que la EGFP perjudica las interacciones actina-miosina en las células musculares e induce una cardiomiopatía dilatada en los ratones con EGFP , resulta tentador especular que la ubiquitinación de la actina podría desempeñar un papel esencial en el funcionamiento normal del músculo y que su desregulación por la EGFP causa los fenotipos mencionados. Por lo tanto, en vista del papel emergente de la ubiquitinación en numerosos procesos celulares, el uso de EGFP como reportero de células vivas debe ser considerado cuidadosamente.
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