La doxiciclina es antiinflamatoria e inhibe las citocinas y quimiocinas inducidas por la exotoxina estafilocócica

La toxina del síndrome de shock tóxico estafilocócico 1 (TSST-1) y las exotoxinas estructuralmente relacionadas son exotoxinas bacterianas que se unen directamente a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II en las células presentadoras de antígenos (1, 5, 8, 18, 23) y activan las células T que expresan elementos Vβ específicos (7). Estas toxinas se denominan superantígenos por su capacidad de estimular policlonalmente a grandes poblaciones de células T (1, 4, 7, 14). Así pues, las exotoxinas estafilocócicas (SE) son potentes activadores del sistema inmunitario y causan diversas enfermedades en los seres humanos, como la intoxicación alimentaria, el shock tóxico y las enfermedades autoinmunes (1, 2, 6, 12, 14, 22). Sus interacciones con las células del sistema inmunitario dan lugar a una producción masiva de citocinas y quimiocinas proinflamatorias (1, 4, 15, 17). Las citocinas factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), interleucina-1 (IL-1) e interferón gamma (IFN-γ) son mediadores clave en el shock tóxico inducido por superantígenos (1, 21). Tanto el TNF-α como la IL-1 tienen potentes actividades inmunoestimulantes y actúan de forma sinérgica con el IFN-γ para potenciar las reacciones inmunitarias y promover las lesiones tisulares (16). En consecuencia, estas citocinas son patógenas a altas concentraciones in vivo y son responsables de la fiebre y el shock tóxico inducido por la SE (13, 14, 18, 19).

La doxiciclina es un antibiótico de amplio espectro ampliamente utilizado para las infecciones causadas por microorganismos tanto gramnegativos como grampositivos. Actúa como agente bacteriostático y es muy eficaz contra muchos microorganismos, como Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus anthracis y Yersinia pestis. La doxiciclina pertenece a la familia de antibióticos de las tetraciclinas, cuyos miembros han demostrado tener otras acciones biológicas independientes de sus efectos antimicrobianos (10). La doxiciclina inhibe la metaloproteinasa de la matriz 8 (MMP-8) y la MMP-9 mediadas por el forbol-12-miristato-13-acetato en las células endoteliales humanas (11). La doxiciclina también disminuye la degradación de la elastina y reduce la actividad de las MMP en un modelo de enfermedad aneurismática (3). Más recientemente, se demostró que la doxiciclina inhibe la producción de IL-1β en cultivos epiteliales corneales tratados con lipopolisacáridos en una medida comparable a la lograda por los corticosteroides (25). In vivo, la doxiciclina protegió a los ratones de la endotoxemia letal al regular a la baja la secreción de citoquinas y nitratos en la sangre (20). Este estudio se llevó a cabo para determinar el efecto modulador de la doxiciclina sobre la activación de células T inducida por superantígenos estafilocócicos y la producción de citoquinas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

Las PBMC humanas se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque de sangre heparinizada de donantes humanos normales. Las PBMC (106/ml) se cultivaron a 37°C en placas de 24 pocillos que contenían medio RPMI 1640 y suero bovino fetal inactivado por calor al 10%. Las células se incubaron con SEB (200 ng/ml) o TSST-1 (200 ng/ml) durante 16 horas, y se recogieron los sobrenadantes y se analizaron en busca de IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, MCP-1, MIP-1α y MIP-1β. Las citocinas y quimiocinas se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas con anticuerpos específicos para citocinas o quimiocinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (15, 17). Se utilizaron citocinas y quimiocinas recombinantes humanas (20 a 1.000 pg/ml) como estándares para la calibración en cada placa. El límite de detección de cada ensayo fue de 20 pg/ml. Los datos de las citocinas y quimiocinas se expresaron como la lectura media ± la desviación estándar (SD) de muestras duplicadas. La doxiciclina, cuando estaba presente, se añadió simultáneamente con el agente estimulante. La citotoxicidad se midió por la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) del citosol en el sobrenadante del cultivo. La LDH se cuantificó utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad colorimétrico (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La cantidad máxima de LDH liberable (100%) se obtuvo lisando las células con Tritón X-100 al 1%. La proliferación de células T se ensayó con PBMC (105/pocillo), que se sembraron por triplicado con SEB o TSST-1 (200 ng/ml), con o sin doxiciclina, durante 48 h a 37°C en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células fueron pulsadas con 1 μCi de timidina (New England Nuclear, Boston, Mass.) por pozo durante las últimas 5 h de cultivo, como se ha descrito previamente (15). Las células se cosecharon en filtros de fibra de vidrio y la timidina incorporada se midió por centelleo líquido. Todos los datos se analizaron en busca de diferencias significativas mediante la prueba t de Student con Stata (Stata Corp., College Station, Tex.). Las diferencias entre los grupos tratados con doxiciclina y los grupos de control no tratados se consideraron significativas si P era <0,05.

Sobre la base del informe de que la doxiciclina bloqueó la IL-1 inducida por el lipopolisacárido en las células epiteliales y evitó la endotoxemia letal in vivo (20, 25), probamos la hipótesis de que este antibiótico podría tener efectos directos sobre las citocinas inducidas por la SE. Como se muestra en la Fig. 1, la doxiciclina inhibió de forma dependiente de la dosis la producción de las citocinas IL-1β, IL-6, TNF-α e IFN-γ y las quimiocinas MCP-1, MIP-1α y MIP-1β por las PBMC incubadas con SEB. También se observó una reducción similar, dependiente de la dosis, de las citocinas y quimiocinas por parte de la doxiciclina en las PBMC estimuladas con TSST-1 (datos no mostrados). El efecto inhibidor de la doxiciclina sobre las citocinas y quimiocinas mediadas por SEB o TSST-1 obtenidas con PBMC de siete donantes normales se resume en la Fig. 2. La producción de MCP-1 e IFN-γ fue completamente bloqueada por 50 μM de doxiciclina. Esta concentración de doxiciclina redujo la IL-1β, la IL-6, el TNF-α, el MIP-1α y el MIP-1β hasta un 15 a 22%, un 37 a 41%, un 21 a 25%, un 10 a 15% y un 59 a 61% de la de las células no tratadas, estimuladas con SEB o con TSST, respectivamente. El TNF-β, cuando estaba presente, también se inhibió en un 25% respecto a las células no tratadas y estimuladas con SEB. La doxiciclina no fue citotóxica para las PBMC a esta concentración, según se midió por la exclusión del azul tripán y la falta de liberación de lactato deshidrogenasa de las células tratadas. La inhibición completa de estas citocinas y quimiocinas se observó a dosis altas de doxiciclina (>0,1 mM). Se observó una inhibición similar de la respuesta a la dosis por parte de la doxiciclina a concentraciones más bajas de SEB (1 y 10 ng/ml) (datos no mostrados).

Debido a que los superantígenos también provocan la proliferación de células T, se investigó el efecto de la doxiciclina sobre la proliferación de células T inducida por SE. La figura 3 muestra que la doxiciclina inhibió la proliferación de células T estimulada por SEB y TSST-1 de forma dependiente de la dosis, alcanzando una inhibición del 98% a 0,05 mM.

Este estudio demostró que la doxiciclina inhibió eficazmente la producción de citocinas y quimiocinas mediada por superantígenos en PBMC humanas in vitro. También se suprimió por completo la proliferación de células T inducida por superantígenos estafilocócicos. La regulación a la baja de las citocinas y quimiocinas proinflamatorias por parte de la doxiciclina en las PBMC estimuladas por SEB y TSST-1 sugirió que la doxiciclina podría afectar a la fisiopatología del shock tóxico. Estos resultados amplían las observaciones de otros investigadores sobre los efectos inmunomoduladores de la doxiciclina además de sus actividades antimicrobianas.

Múltiples mecanismos moleculares, tanto transcripcionales como postranscripcionales, pueden estar implicados en los efectos antiinflamatorios de la doxiciclina (11, 26). La supresión de las citocinas proinflamatorias puede implicar la regulación a la baja de la vía de la PKC por parte de la doxiciclina, como sugiere un estudio de sus efectos sobre la formación de granulomas (26). La dosis inhibitoria de doxiciclina (10 a 15 μM) que reduce la colagenasa, la gelatinasa y otras metaloproteinasas in vitro (10, 11) es comparable a la utilizada en este estudio y es varias veces superior a la observada en el suero humano tras una dosis oral de 200 mg diarios (10, 24). Sin embargo, los estudios clínicos indican que esta dosis fue suficiente para reducir las actividades de colagenasa y gelatinasa en extractos de cartílago osteoartrítico humano ex vivo (24). Se ha demostrado que una dosis subantimicrobiana de doxiciclina (20 mg dos veces al día) inhibe la actividad de la colagenasa del líquido gingival (9). Además, en estudios in vivo de endotoxemia experimental también se observó que la doxiciclina y otras tetraciclinas son eficaces para regular a la baja las citocinas inflamatorias y prevenir el choque (20).

En conclusión, los resultados presentados aquí indican que la doxiciclina regula a la baja las citocinas y quimiocinas proinflamatorias, lo que sugiere su utilidad potencial para tratar el choque tóxico inducido por superantígenos. En un entorno clínico en el que el huésped está expuesto a múltiples agentes biológicos, incluyendo tanto bacterias como exotoxinas bacterianas, el uso de doxiciclina ofrece la ventaja adicional de proporcionar efectos tanto antimicrobianos como antiinflamatorios.