En el sistema HC-FIA, las FNP funcionalizadas con ADN de la sonda amplifican la señal de la hibridación del ARN viral y el ADN de la sonda. El principio de diseño del biosensor HC-FIA se muestra en la Fig. 1.
a, El principio de HC-FIA. b, Resultados representativos en una tira de flujo lateral. c, El dispositivo de análisis de fluorescencia. d, Una fotografía del laboratorio de maleta portátil, que tiene una longitud de 55,5 cm, una anchura de 37 cm y una altura de 23 cm, con un peso de 8,5 kg. e, El proceso de prueba del ensayo HC-FIA. Paso 1: hibridación del ácido nucleico en una incubadora a temperatura constante. Paso 2: determinación de la intensidad de las señales de fluorescencia en la tarjeta de prueba utilizando el dispositivo mostrado en c. f, Distribución de la sonda en el genoma del SARS-CoV-2.
Diseño y funcionamiento del ensayo HC-FIA
Los anticuerpos monoclonales murinos S9.6 murino se fijan previamente en la línea de prueba (T) de la tira de flujo lateral, y la línea de control (C) se recubre con anticuerpos policlonales IgG de cabra anti-conejo (Fig. 1a). Las FNP marcadas con anticuerpos S9.6 e IgG de conejo se colocan en el tubo de reacción. Al comienzo del proceso de detección, el SARS-CoV-2 presente en el hisopo de garganta o en la muestra de esputo es lisado y liberado, y el ARN liberado se hibrida con la sonda específica de ADN del SARS-CoV-2. El híbrido ARN-ADN resultante es capturado por los anticuerpos S9.6 marcados con FNP, y el complejo fluye a lo largo de la almohadilla de la muestra y la membrana de nitrocelulosa hacia el papel absorbente bajo fuerzas capilares. Al pasar por la zona T, el complejo es capturado por los anticuerpos S9.6, generando gradualmente una señal fluorescente. En la zona C, la IgG de conejo marcada con FNP es capturada por la IgG de conejo. La presencia o ausencia del ARN del SARS-CoV-2 objetivo se basa en un valor de corte para la intensidad de la fluorescencia (Fig. 1b,c). La figura 1d muestra un laboratorio de maleta portátil que tiene la capacidad de proporcionar resultados cualitativos en menos de una hora después de los dos pasos siguientes: hibridación y análisis de inmunofluorescencia (Fig. 1e).
Aquí utilizamos la relación de la señal de fluorescencia de la prueba con respecto a la señal de fluorescencia de control (T/C) en la tira de flujo lateral, de forma que la influencia de cualquier fluorescencia de fondo de la tarjeta de prueba se minimizara. Al medir la relación T/C de las muestras de frotis de garganta de 211 individuos sanos, descubrimos que la relación T/C de fondo media era de 49,95, con una densidad relativa de 17,16 (Fig. suplementaria 1a). Se utilizó la curva de características operativas del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC) para determinar el valor de corte y evaluar la precisión diagnóstica del ensayo HC-FIA sobre la base de la sensibilidad y la especificidad en varios umbrales. Se determinó una curva ROC con un AUC de 0,999 con un intervalo de confianza (IC) del 95% de 0,997-1,000 (Fig. Suplementaria 1b) utilizando muestras de hisopos de garganta de 100 casos de COVID-19 clínicamente confirmados y excluidos. Se determinó que el valor de corte que obtuvo la mayor sensibilidad y especificidad fue de 102,07, correspondiente al punto del índice de Youden de 0,980. Alternativamente, un valor umbral de dos veces el valor de fondo negativo (aquí, 49,95 × 2 = 99,90) se suele utilizar como valor de corte en los inmunoensayos. Por conveniencia, elegimos un valor de corte T/C de 100,00.
Desarrollo del ensayo HC-FIA
La optimización de las sondas de ADN para la secuencia de ARN objetivo del SARS-CoV-2 es clave para mejorar la eficiencia del ensayo. En la tabla suplementaria 1 se ofrece una lista de todas las secuencias de sondas de ADN que hemos diseñado. El genoma del SARS-CoV-2 comprende aproximadamente 30.000 bases, incluyendo un número variable (6-11) de marcos de lectura abiertos (ORF). El primer ORF representa aproximadamente el 67% de todo el genoma y codifica 16 proteínas no estructurales, así como proteínas auxiliares y proteínas estructurales. Las cuatro principales proteínas estructurales son la glicoproteína de la espiga (S), la pequeña proteína de la envoltura (E), la proteína de la matriz (M) y la proteína de la nucleocápside (N)15,16. La mayoría de los ensayos de detección de ácido nucleico para el SARS-CoV-2 utilizan las siguientes tres regiones conservadas en el genoma viral: ORF1ab, en la que se encuentra el gen de la polimerasa dependiente de ARN (rdrp)15, y las regiones que codifican N y E.
Comenzamos por recuperar la secuencia del genoma del ARN del SARS-CoV-2 del GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (números de acceso, MN908947, MN908947.3, MN908947.2 y NC_045512.1). Un análisis detallado de otras secuencias publicadas del genoma del SARS-CoV-2 no reveló ninguna variación notable en estas regiones. Con la ayuda del software de diseño Primer Premier 5.0, diseñamos tres sondas para cada una de las tres regiones: CoV01 y CoV04, situadas en la región recomendada para la detección de ORF1ab y N, respectivamente; y CoV08, en la misma región que E17. Las posiciones de los sitios de unión de las sondas en la secuencia del genoma de referencia (NC_045512.2) se indican en la Fig. 1f.
Se realizó una alineación de secuencias entre las sondas de ADN diseñadas y las secuencias del genoma humano y de los genomas de virus, bacterias, micoplasmas, clamidias y otros patógenos comunes. Las sondas sólo coincidían con la secuencia genómica del SARS-CoV-2, y no se encontró ninguna homología con el ADN genómico humano. Como controles positivos se utilizaron pseudovirus portadores de diferentes regiones del gen diana construidos utilizando lentivirus como vectores. Las secuencias del gen diana de los pseudovirus utilizados se muestran en la Tabla Suplementaria 2. P1 fue positivo para la región N del SARS-CoV-2, P2 para la región E del SARS-CoV-2 y P3 para la región ORF1ab del SARS-CoV-2. La concentración de los tres controles positivos fue de 3.000 unidades de transducción (UT) ml-1, lo que indica que había 3.000 partículas de virus infecciosas por ml. Como controles negativos de N1-N17 se utilizó solución salina fisiológica, agua purificada y muestras de hisopos faríngeos positivos para otros patógenos comunes. En la Tabla Suplementaria 3 se ofrece una lista de información sobre las referencias positivas y negativas utilizadas en el estudio. Los resultados de las pruebas se muestran en las Tablas Suplementarias 4-6. Para la región ORF1ab, se seleccionaron las sondas CoV01 y CoV03; para la región E, se seleccionó la sonda CoV08; y para la región N, las sondas CoV04 y CoV06 se unieron preferentemente al ARN objetivo. Las sondas de ADN seleccionadas se optimizaron aún más por combinación (Tabla Suplementaria 7), con cada grupo de sondas dirigidas simultáneamente a los tres segmentos. Los resultados de la prueba HC-FIA en la Tabla Suplementaria 8 muestran que la combinación de las sondas Cov01, Cov04 y Cov08 (grupo 2) discriminó entre todas las muestras de control positivas y los controles negativos, y detectó muestras positivas con un título viral bajo (1.000 TU ml-1; Tabla Suplementaria 3, L1-L3) con una tasa de positividad superior al 95%. Por lo tanto, se seleccionó el grupo 2 como combinación final. Hasta la fecha, hay 13.411 secuencias de nucleótidos del SARS-CoV-2 publicadas en el NCBI. La alineación de las tres sondas con la región diana correspondiente en las 13.411 secuencias cargadas reveló que las regiones diana de las sondas se conservaban lo suficiente como para obtener una similitud del 100%.
También optimizamos las condiciones de prueba del ensayo, en particular el tiempo de incubación para la hibridación y el tiempo de lectura de la tira de prueba. El rendimiento del ensayo para tiempos de incubación de 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min y 60 min a 56 °C se muestra en la Tabla suplementaria 9. Obsérvese que 20 minutos fueron suficientes para que las sondas de ADN se hibridaran con la región diana, lo que se reflejó en la tasa positiva del 100% en la detección de muestras positivas de frotis de garganta y esputo con un título viral bajo (1.000 TU ml-1; Tabla suplementaria 3, L1-L3). Cuando el tiempo de incubación se amplió a 50 o 60 minutos, la reacción no fue tan estable, ya que la tasa de positivos de las muestras de referencia L1-L3 disminuyó. Teniendo en cuenta la eficacia de la detección y el requisito de inactivación del virus, seleccionamos 30 min como tiempo de incubación para la hibridación a 56 °C. También evaluamos el tiempo de lectura de la tira para los valores 10 min, 12 min, 15 min y 18 min (Tabla suplementaria 10). Los resultados indicaron que 12 min o más condujeron a la detección correcta de las muestras de referencia positivas y negativas. Sin embargo, el coeficiente de variación (CV) fue inferior al 10% para la detección de muestras positivas con un título viral bajo sólo cuando se utilizó un tiempo de lectura de 15 min. Por lo tanto, se seleccionó un tiempo de lectura de 15 minutos.
Se compararon el tiocianato de guanidinio y el cloruro de guanidina -los desnaturalizantes de proteínas más utilizados para la extracción de ácidos nucleicos- como medios de transporte para la conservación de las muestras. El tiocianato de guanidinio dio mejores resultados a la hora de discriminar entre muestras positivas y negativas, con un CV relativamente bajo para las muestras con un título viral bajo. De hecho, el tiocianato de guanidinio a una concentración de hasta 6 mol l-1 ha mostrado excelentes propiedades antivirales18. Seleccionamos el tiocianato de guanidinio a una concentración de 5 mol l-1 como desnaturalizador de proteínas para la inactivación viral en el medio de transporte.
Especificidad del ensayo HC-FIA
Después de optimizar las secuencias de la sonda y las condiciones de reacción, examinamos la especificidad del ensayo HC-FIA para detectar el SARS-CoV-2. Los controles positivos incluían pseudovirus (muestras P1-P3) con genes diana, y cinco muestras clínicas de frotis de garganta (muestras P4-P8), confirmadas mediante un kit de detección de ácido nucleico basado en RT-qPCR (Shanghai ZJ Bio-Tech). Los controles negativos, que consistían en muestras de frotis de garganta, se confirmaron como negativos para el SARS-CoV-2, y positivos para la gripe A, la gripe B, el virus sincitial respiratorio, la clamidia pneumoniae, el adenovirus u otros patógenos (muestras N5-N17), o pseudovirus positivos para la región N del MERS (muestra N18) o el SARS (muestra N19). La lista de todas las muestras figura en la Tabla Suplementaria 3. En la tabla suplementaria 11 se proporciona una lista de los resultados de detección de 8 muestras de referencia positivas y 15 muestras de referencia negativas.
Investigamos si había reactividad cruzada entre el SARS-CoV-2 y 55 patógenos comunes que causan enfermedades respiratorias. La fuente y la información cuantitativa de cada microorganismo patógeno se proporcionan en el conjunto de datos suplementario 1. El título original del virus se determinó en 106 unidades formadoras de placas por ml mediante un ensayo de placas. Para las muestras de interferencia de bacterias, micoplasma y clamidia, el nivel de concentración fue de 107 unidades formadoras de colonias por ml. Además, se extrajo ADN genómico humano y se cuantificó en 90-105 µg ml-1 a partir de tres muestras de sangre total. El ensayo HC-FIA mostró una excelente especificidad para el SARS-CoV-2, sin una reactividad cruzada evidente con todas las demás muestras de patógenos y el ADN genómico humano (conjunto de datos suplementario 1).
Como el anticuerpo monoclonal S9.6 también se une a dúplex de ARN-ARN19, especialmente a los ricos en UA20, diseñamos secuencias de ARN de doble cadena con fracciones variables de UA. La información detallada de la secuencia se proporciona en la Tabla Suplementaria 12. Como se muestra en la Tabla Suplementaria 13, independientemente del contenido de UA, el ensayo HC-FIA no mostró una señal positiva detectable hacia el ARN de doble cadena, lo que indica que hay una baja afinidad de unión entre el anticuerpo S9.6 y el ARN de doble cadena en las condiciones del ensayo. También investigamos si la presencia de ARN de doble cadena afecta al rendimiento del ensayo en la detección de muestras clínicas de frotis de garganta o esputo. Se utilizaron 2 muestras de exudado faríngeo positivas, 2 muestras de esputo positivas, 10 muestras de exudado faríngeo negativas y 5 muestras de esputo negativas. Medimos los ratios T/C con respecto a los valores T/C de la prueba sin interferencias, y descubrimos que los ratios oscilaban entre 0,9 y 1,1 (Conjunto de datos suplementario 1). Esto indica que la presencia de ARN de doble cadena, independientemente del contenido de UA, no afecta significativamente al rendimiento del ensayo HC-FIA.
Sensibilidad y precisión del ensayo HC-FIA
Diluimos en serie las muestras de pseudovirus que contenían tres secciones de genes diana a títulos de 5.000, 2.500, 1.000, 800, 500, 250 y 100 TU ml-1, y calculamos los valores T/C medios de 20 ensayos paralelos. La Figura 2a muestra que los valores del límite de detección (LOD) de los pseudovirus positivos para las regiones N, E u ORF1ab del SARS-CoV-2 eran tan bajos como 1.000 TU ml-1, con una tasa de positivos superior al 95%. Cuando los títulos de las muestras de pseudovirus alcanzaron las 108 TU ml-1, no se observó ningún efecto de gancho notable (Fig. 2 suplementaria). El rango lineal del ensayo corresponde a títulos entre 103 y 106 o 107 TU ml-1.
Los ejes verticales muestran la relación fluorescencia-intensidad (T/C) de la señal de ensayo (T) y la señal de control (C). Para cada concentración, se realizaron 20 ensayos en paralelo. El LOD se determinó como la concentración en la que la tasa de positivos era mayor o igual al 95%. a, Relaciones T/C para muestras de pseudovirus diluidas en serie positivas para las regiones N, E y ORF1ab del SARS-CoV-2. b, Relaciones T/C para muestras de hisopos de garganta diluidas en serie de tres pacientes críticos. Los datos son la media ± d.s.
Las muestras de exudado faríngeo de tres pacientes en estado crítico -que se determinó que eran positivas para el SARS-CoV-2 mediante RT-qPCR, y las cargas virales se cuantificaron mediante PCR digital- se mezclaron con muestras de exudado faríngeo negativas para preparar diluciones en serie de 2.000, 1.000, 500, 400 y 250 copias por ml. Como se muestra en la Fig. 2b, el LOD fue de 500 copias por ml con una tasa positiva superior al 95%. Para verificar el LOD se utilizaron muestras clínicas de frotis de garganta con valores T/C cercanos al valor crítico (100) para la positividad (muestras con 512, 489 y 497 copias por ml de la región ORF1ab, según la PCR digital) (pruebas realizadas 20 veces en paralelo). Las tasas de positividad de estas muestras fueron superiores al 95% (Tablas suplementarias 14-16).
Para evaluar la precisión del kit HC-FIA, se realizaron pruebas en paralelo 20 veces para cada muestra clínica de hisopo de garganta durante cinco días consecutivos. Las muestras clínicas representativas elegidas fueron una muestra positiva (1.348 copias por ml de la región ORF1ab), una muestra de un individuo en estado crítico (crítico; 512 copias por ml) y una muestra negativa (0 copias por ml). Los valores medios de T/C de los tres lotes en la detección de la muestra positiva fueron los siguientes 199,92 ± 8,25 (CV = 4,13%), 200,68 ± 7,91 (CV = 3,94%) y 199,03 ± 7,43 (CV = 3,73%), respectivamente, frente a 109,17 ± 5,68 (CV = 4,65%), 110,80 ± 5.63 (CV = 5,08%) y 111,48 ± 4,67 (CV = 4,19%) para la muestra crítica, y con 44,66 ± 3,36 (CV = 7,52%), 43,99 ± 2,72 (CV = 6,18%) y 44,72 ± 2,98 (CV = 6.66%) para la muestra negativa. Los valores de CV entre lotes fueron de 3,89%, 4,66% y 6,74%. Por lo tanto, el ensayo mostró una buena precisión y reproducibilidad para la detección del SARS-CoV-2.
Robustez del ensayo HC-FIA
Para conocer la robustez del HC-FIA, evaluamos los efectos de las sustancias de interferencia endógenas (como la hemoglobina y la mucina) y de las sustancias de interferencia exógenas (en particular, los fármacos clínicos utilizados habitualmente en el tratamiento de pacientes con infecciones respiratorias, incluidos los fármacos antivirales, los antibióticos y las hormonas). Para este experimento, utilizamos 18 muestras clínicas de frotis de garganta, incluyendo seis muestras críticas (500-530 copias por ml para la región ORF1ab, según la PCR digital), seis muestras negativas y seis muestras positivas. Los resultados también se registraron como la relación de los valores T/C (muestras de interferencia frente a muestras de control). En las muestras de interferencia preparadas, las concentraciones de hemoglobina fueron de 0,5 g l-1, 1,0 g l-1 y 2,0 g l-1, y las concentraciones de mucina fueron de 5 g l-1, 10 g l-1 y 20 g l-1. Las concentraciones de fármacos de las muestras de interferencia exógena (Tablas Suplementarias 17-19) fueron mucho más altas que sus concentraciones plasmáticas máximas in vivo. Como se esperaba, todas las relaciones T/C estaban en el rango de 0,9-1,1 (Conjunto de datos suplementario 2), lo que indica que el ensayo HC-FIA es robusto a la interferencia.
Evaluación clínica del kit de prueba HC-FIA
Para evaluar aún más el rendimiento del ensayo HC-FIA, se llevó a cabo un ensayo clínico aleatorio doble ciego comparando el ensayo con la RT-qPCR (kit de detección del SARS-CoV-2 producido por Shanghai ZJ Bio-Tech, y aprobado por la NMPA) o con los resultados del diagnóstico clínico en tres instituciones médicas independientes. El kit de prueba HC-FIA utilizado en la evaluación clínica contenía tarjetas de prueba, tampón de lisis, solución de conservación de muestras, controles positivos y negativos, y un tubo de reacción con sondas de ADN y anticuerpos marcados. Los resultados del diagnóstico clínico de los casos confirmados o excluidos de COVID-19, que fueron proporcionados por los hospitales designados, se basaron en imágenes de tomografía computarizada y en las manifestaciones clínicas de los pacientes, tal como se especifica en las directrices del «Protocolo de diagnóstico y tratamiento de la nueva neumonía por coronavirus (versión de prueba 6.0)» de China. Se analizaron en paralelo un total de 734 muestras (593 hisopos de garganta y 141 esputos) proporcionadas por 670 individuos. Los datos brutos de los ensayos clínicos se proporcionan como conjunto de datos suplementarios 3. El kit de detección RT-qPCR que utilizamos se diseñó como un sistema de tres objetivos (ORF, N y E), y seguimos el principio de test-retest para discriminar entre muestras positivas y negativas. Además de cuatro pruebas fallidas causadas por un estándar interno inválido, se realizaron ocho repruebas: una porque sólo un gen rdrp objetivo fue positivo, y siete porque sólo los genes N y E fueron positivos. En estos casos, se excluyeron los resultados negativos anteriores.
De los 670 pacientes inscritos en el ensayo, 313 eran hombres (46,72%) y 357 eran mujeres (53,28%). Como se muestra en la Fig. Suplementaria 3, la distribución por edades de la población inscrita es similar a la distribución por edades de la infección por SARS-CoV-221. La tasa de visitas y la tasa de diagnóstico también estaban equilibradas. Los resultados de los kits de prueba HC-FIA se muestran en la Fig. 3, que muestra fotografías de resultados típicos bajo una fuente de luz fluorescente y la correspondiente matriz de color de gradiente tras la normalización de la lectura. La matriz de color de gradiente de la Fig. 4 suplementaria muestra las lecturas de fluorescencia normalizadas de 734 muestras clínicas (conjunto de datos suplementario 3).
Fotografías de resultados típicos bajo una fuente de luz fluorescente, y las correspondientes lecturas de fluorescencia como una matriz de gradiente de color, normalizada al valor máximo de lectura. El grupo E se compone únicamente de resultados COVID-19-negativos. La línea horizontal de la barra de color indica el valor de corte. La matriz de gradiente de color para las lecturas de fluorescencia de 734 muestras clínicas se proporciona en la Fig. Suplementaria 4, y los datos numéricos correspondientes en el Conjunto de Datos Suplementario 3.
Para 621 casos, los resultados de la HC-FIA y los diagnósticos clínicos eran coherentes (210 casos confirmados y 411 casos excluidos; Tabla 1); 49 casos (27 confirmados y 22 excluidos por diagnóstico clínico) no eran coherentes con los resultados de la HC-FIA. En 730 muestras, los resultados de la prueba HC-FIA fueron coherentes con la RT-qPCR (249 positivos y 481 negativos; Tabla 1). Cuatro muestras que fueron negativas en base a la RT-qPCR fueron positivas utilizando la HC-FIA. Tres de estas muestras procedían de pacientes diagnosticados clínicamente como excluidos de COVID-19, lo que indica que la prueba HC-FIA había dado resultados falsos positivos. La muestra restante correspondía a un caso confirmado por diagnóstico clínico, de acuerdo con la prueba HC-FIA.
La Kappa de Cohen (κ), que es una métrica frecuentemente utilizada para medir la fiabilidad de la concordancia entre variables categóricas, es una medida más robusta en comparación con el simple porcentaje de concordancia entre las variables, ya que κ tiene en cuenta los acuerdos que se producen por azar, especialmente en conjuntos de datos desequilibrados. Consideramos que un valor κ superior a 0,75 indica un alto nivel de acuerdo (el acuerdo perfecto corresponde a un κ = 1). Como se muestra en la Tabla 2, los resultados de la prueba de HC-FIA estaban en alta concordancia con el diagnóstico clínico (κ = 0,8393) y con la RT-qPCR (κ > 0,98, independientemente del tipo de muestra).
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