Métodos, técnicas y protocolos de inmunocitoquímica

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Para asegurar el libre acceso del anticuerpo a su antígeno, las células deben ser fijadas y permeabilizadas. En general, las fuerzas y los tiempos de fijación son considerablemente más cortos para las células que en las secciones de tejido más gruesas y estructuralmente complejas. Para la inmunocitoquímica, la preparación de la muestra consiste esencialmente en fijar las células objetivo al portaobjetos. Una fijación perfecta inmovilizaría los antígenos, conservando la auténtica arquitectura celular y subcelular y permitiendo el acceso sin obstáculos de los anticuerpos a todas las células y compartimentos subcelulares. Se suele utilizar una amplia gama de fijadores, y la elección correcta del método dependerá de la naturaleza del antígeno que se examine y de las propiedades del anticuerpo utilizado. Los métodos de fijación se dividen generalmente en dos clases: disolventes orgánicos y reactivos de reticulación. Los disolventes orgánicos, como los alcoholes y la acetona, eliminan los lípidos y deshidratan las células, al tiempo que precipitan las proteínas de la arquitectura celular. Los reactivos de reticulación (como el paraformaldehído) forman puentes intermoleculares, normalmente a través de grupos amino libres, creando así una red de antígenos enlazados. Los reticulantes preservan la estructura celular mejor que los disolventes orgánicos, pero pueden reducir la antigenicidad de algunos componentes celulares, y requieren la adición de un paso de permeabilización, para permitir el acceso del anticuerpo a la muestra. La fijación con ambos métodos puede desnaturalizar los antígenos proteicos, y por esta razón, los anticuerpos preparados contra proteínas desnaturalizadas pueden ser más útiles para la tinción celular. Se describen diferentes métodos de fijación. El método de fijación apropiado debe elegirse según la aplicación pertinente.

1. Fijación con acetona

  • Fijar las células en acetona a -20°C durante 5-10 minutos.

  • No es necesario un paso de permeabilización tras la fijación con acetona.

2. Fijación con metanol

  • Fijar las células en metanol a -20°C durante 5-10 minutos.

  • No es necesario el paso de permeabilización después de la fijación con metanol.

3. Fijación con etanol

  • Fijar las células en etanol enfriado al 95%, ácido acético glacial al 5% durante 5-10 minutos.

4. Fijación en metanol-acetona

  • Fijar en metanol enfriado, 10 minutos a -20 °C.

  • Retirar el exceso de metanol.

  • Permeabilizar con acetona enfriada durante 1 minuto a -20 °C.

5. Fijación con mezcla de metanol y acetona

  • Mezcla 1:1 de metanol y acetona.

  • Hacer la mezcla en fresco y fijar las células a -20 C durante 5-10 minutos.

6. Fijación con mezcla de metanol y etanol

  • Mezcla 1:1 de metanol y etanol.

  • Haga la mezcla en fresco y fije las células a -20 C durante 5-10 minutos.

7. Fijación con formalina

  • Fijar las células en formalina neutra tamponada al 10% durante 5-10 minutos.

  • Enjuagar brevemente con PBS.

  • Permeabilizar con Tritón X-100 al 0,5% durante 10 minutos.

8. Fijación con paraformaldehído-Tritón

  • Fijar en paraformaldehído al 3-4% durante 10-20 minutos.

  • Enjuagar brevemente con PBS.

  • Permeabilizar con Tritón X-100 al 0,5% durante 10 minutos.

9. Fijación con paraformaldehído y metanol

  • Fijar en paraformaldehído al 4% durante 10-20 minutos.

  • Enjuagar brevemente con PBS.

  • Permeabilizar con metanol enfriado durante 5-10 minutos a -20 °C.