Abstract

El género Mycobacterium es causante de diversas enfermedades zoonóticas. El ejemplo más conocido es la tuberculosis zoonótica debida a M. bovis. Se sabe mucho menos sobre las «micobacterias no tuberculosas (MNT)», que también están asociadas a infecciones en humanos. La norma mexicana NOM-ZOO-031-1995 regula la presencia de M. bovis en el ganado bovino; sin embargo, no existe ninguna regulación para las especies NTM. El objetivo de este estudio fue aislar e identificar especies de micobacterias no tuberculosas de bovinos de hatos locales de la región sur del Estado de México mediante la identificación y detección del marcador molecular de 100 pb en el gen del ARNr 23S con posterior secuenciación del gen del ARNr 16S. Se recogieron muestras de leche (35) y de exudado nasal (68). De las 108 cepas aisladas, se seleccionaron 39 para su identificación. Trece cepas aisladas de exudados nasales amplificaron el marcador molecular de 100 pb y se identificaron como M. neoaurum (seis cepas), M. parafortuitum (cuatro cepas), M. moriokaense (dos cepas) y M. confluentis (una cepa). Excepto M. parafortuitum, las demás especies identificadas son motivo de preocupación para la salud pública y la veterinaria, ya que son patógenas para los seres humanos, especialmente para los que padecen enfermedades subyacentes.

1. Introducción

El género Mycobacterium causa una amplia variedad de enfermedades zoonóticas. El ejemplo más conocido es la tuberculosis zoonótica debida a M. bovis, cuyo principal reservorio es el ganado vacuno. M. bovis forma parte del «complejo de la tuberculosis», que también incluye las especies M. tuberculosis, M. africanum, M. caprae y M. microti.

Dentro del grupo de las micobacterias se encuentran las «micobacterias no tuberculosas (MNT)», que también están asociadas a infecciones en humanos. Las MNT se encuentran en diversas fuentes ambientales como el suelo, el agua, la vegetación, los animales, los productos lácteos y las heces, y pueden transmitirse inadvertidamente por inhalación, ingestión o penetración en la piel.

La norma mexicana NOM-ZOO-031-1995 regula la presencia de M. bovis en el ganado bovino para controlar y erradicar la tuberculosis bovina (TBB); sin embargo, no existe ninguna regulación para las especies de MNT. El diagnóstico oficial de la tuberculosis bovina por la presencia de M. bovis a nivel de campo se basa en la prueba intradérmica con un derivado proteico purificado (tuberculina) . Aunque se utiliza desde hace varios años, esta prueba no ofrece una buena sensibilidad y especificidad. Aproximadamente el 20% de los animales con tuberculosis no reaccionan a la prueba , y la presencia de otras especies de micobacterias, tanto del complejo tuberculoso como de las especies NTM, provoca interferencias que conducen a diagnósticos falsos positivos y falsos negativos.

Aunque México cuenta con una norma reguladora, en algunas zonas se reporta una prevalencia de bTB superior al 2% . Dada la escasa especificidad y sensibilidad de la prueba de la tuberculina, es probable que la presencia real de M. bovis sea menor y que la tasa de infección del ganado por otras micobacterias sea mayor, respectivamente. Así pues, los ganaderos, veterinarios, técnicos y empleados que trabajan en la industria ganadera podrían estar ocupacionalmente expuestos a infecciones por M. bovis y NTM. Se sabe muy poco sobre la exposición laboral a las zoonosis debidas a las especies de MNT porque la identificación de estas especies era una tarea bastante difícil antes del desarrollo de las técnicas de identificación basadas en la biología molecular.

Actualmente, las técnicas de biología molecular más utilizadas para el diagnóstico de las enfermedades causadas por micobacterias son el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para el diagnóstico de M. tuberculosis , el espoligotipado para el diagnóstico de M. bovis , y la detección de una «inserción específica» de 100 pares de bases (pb) localizada en el gen 23S rRNA característica de las bacterias Gram-positivas con un alto contenido en guanina-citosina (HGC), que se considera un marcador molecular para este grupo de bacterias , seguido del análisis de la secuencia del gen 16S rRNA para la identificación de las bacterias a nivel de especie .

Entre las especies de MNT identificadas por las técnicas mencionadas se encuentran M. balnei, M. marinum y M. platypoecilus, que han causado lesiones superficiales y profundas en la piel; M. kansasii en lesiones pulmonares; M. simiae en infecciones generalizadas; M. scrofulaceum en infecciones de la piel y órganos internos; M. szulgai en infecciones pulmonares, osteomielitis, tenosinovitis y linfadenitis; M. ulcerans en granulomas subcutáneos; M. fortuitum y M. chelonae asociados a vasculitis, endocarditis, osteomielitis, mediastinitis, meningitis, queratitis y hepatitis ; M. abscessus, asociado a lesiones eritematosas que progresan a nódulos ulcerados ; y otras especies.

El mayor porcentaje del inventario estatal de cabezas de ganado en el Estado de México en México se concentra en la región sur, y una de las principales actividades económicas es la ganadería . La norma mexicana para el control de bovinos NOM-ZOO-031-1995 sólo se centra en la prueba de tuberculina para el diagnóstico de M. bovis. Poco se sabe de la presencia de MNT en el ganado de la región. Dada la posibilidad de identificar especies de actinobacterias mediante la detección del marcador molecular de 100 pares de bases en el gen 23S del ARNr y la posterior secuenciación del gen 16S del ARNr, es posible identificar las especies de MNT mencionadas.

El objetivo del presente estudio fue aislar e identificar especies de MNT de bovinos de la región sur del Estado de México. Las especies de Mycobacterium se aislaron de muestras de exudado nasal y de leche bovina y se identificaron mediante la detección del marcador molecular de 100 pares de bases en el gen 23S del ARNr con la posterior secuenciación del gen 16S del ARNr.

2. Materiales y métodos

2.1. Muestreo

Se realizó un muestreo basado en la distribución espacial de los rebaños positivos a tuberculosis bovina en el estado de México realizado por Zaragoza et al. 2015 . Se seleccionaron cuatro hatos bovinos en la región sur del Estado de México, un hato perteneciente al municipio de Temascaltepec y tres hatos pertenecientes al municipio de Zacazonapan. Se tomaron 103 muestras, 35 de leche y 68 de exudado nasal. La distribución del número y tipo de muestras recolectadas en cada hato se muestra en la Tabla 1.

Característica Herd 1 Herd 2 Herd 3 Herd 4 Total
Municipio Temascaltepec Zacazonapan Zacazonapan Zacazonapan
Raza F1 Swiss-Cebú Holstein Friesian Holstein Friesian Holstein Friesian
Localización geográfica La-19°03′13.7′′Lo-100°13′36.7′′ La-19°03′39.5′′Lo-100°16′30.9′′ La-19°04′0.4′′Lo-100°15′11.5′′ La-19°03′41′′Lo-100°16′06′′
Historia de la bTB Prevalencia Prevalencia Prevalencia Prevalencia
Muestras obtenidas
Leche 15 20 0 0 35
Exudado nasal 0 18 23 27 68
103
La: latitud; Lo: longitud; bTB: tuberculosis bovina. obtenidos del Comité de Fomento y Protección Pecuaria del Estado de México.
Tabla 1
Muestras recolectadas en hatos bovinos de la región sur del Estado de México.

2.2. Obtención de muestras de leche y exudado nasal

La ubre y los pezones se limpiaron con agua purificada y jabón y luego se secaron con toallas de papel, y posteriormente se realizó la asepsia de los pezones con hisopos empapados en alcohol al 70%. Se recogieron cinco mililitros de leche directamente del pezón en recipientes estériles de 20 mL, desechando el flujo inicial. El exudado nasal se recogió directamente del interior del orificio nasal con una torunda estéril de 10 cm de longitud, que se sumergió en una solución salina isotónica (0,85%). Las muestras de leche y exudado nasal se almacenaron a 4°C hasta su procesamiento.

2.3. Procesamiento de las muestras
2.3.1. Aislamiento de micobacterias

Las muestras de leche se centrifugaron a 2500 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 minutos. Los pellets de las muestras de leche y exudado nasal se inocularon en el siguiente medio de cultivo selectivo para micobacterias: Stonebrink (BD BBL 220504), Middlebrook (BD BBL 254521) y Middlebrook (BD BBL 254521) complementado con 6 g de piruvato sódico por litro (Middlebrook-P). Los medios inoculados se incubaron a 37°C durante 8 semanas y se evaluaron cada 3 días.

2.3.2. Clasificación de las cepas aisladas

Las cepas aisladas se distribuyeron en grupos según las siguientes características: pigmentación de la colonia, tiempo de crecimiento y características de la colonia (forma, consistencia, textura y producción de pigmento). Las cepas aisladas se tiñeron con Ziehl-Neelsen para confirmar la presencia de bacilos ácido-resistentes (AFB).

2.4. Se seleccionaron las cepas con características microscópicas similares a las micobacterias (positividad a la prueba de ácido) y dos cepas representativas de cada grupo para su identificación. Para obtener biomasa, las cepas se inocularon en 30 mL de medio de cultivo líquido Middlebrook (BD BBL 254521) en matraces de 125 mL y se incubaron a 37°C durante 7 días. El medio líquido se transfirió a tubos Falcon estériles de 15 mL y se centrifugó durante 15 minutos a 14.000 rpm. A continuación, se eliminó el sobrenadante y se transfirió el pellet a tubos Eppendorf de 1,5 mL; los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm × 5 minutos y se descartó el sobrenadante. Se realizó la extracción de ADN en el pellet resultante utilizando el kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega A1120).

2.5. Detección del marcador molecular en el gen 23S rRNA

El marcador molecular de 100 pb localizado en el gen 23S rRNA se amplificó según la metodología descrita por Roller et al. (1992) utilizando los siguientes cebadores: 23S InsF, 5′-(AC)A(AGT)GCGTAG(AGCT)CGA(AT)GG-3′, y 23S InsR, 5′-GTG(AT)CGGTTT(AGCT)(GCT)GGTA-3′.

La reacción se llevó a cabo utilizando una Taq ADN polimerasa comercial (Promega M1661). Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo térmico: un paso de predesnaturalización durante 5 minutos (94°C); 29 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos (94°C), hibridación durante 45 segundos (46°C), y elongación durante 50 segundos (72°C); y, finalmente, un ciclo de postelongación de 5 minutos (72°C). Los fragmentos amplificados se confirmaron en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (SIGMA 46065).

2.6. Amplificación del gen 16S rRNA

Las cepas que amplificaron el marcador filogenético de 100 pb se seleccionaron para el análisis de secuenciación del 16S rRNA. Se utilizaron los siguientes cebadores para la amplificación: 8f: AGAGTTTGATCMTGCTCAG y 1492r: TACGGYTACCTTGTTACGACTT.

La reacción se llevó a cabo utilizando una Taq ADN polimerasa comercial (Promega M1661). Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo térmico: un paso de predesnaturalización durante 5 minutos (94°C); 34 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos (94°C), hibridación durante 20 segundos (52°C), y elongación durante 1 minuto y 30 segundos (72°C); y, finalmente, un ciclo de postelongación de 7 minutos (72°C).

Los fragmentos amplificados se confirmaron en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (SIGMA 46065). Los productos de esta amplificación se purificaron utilizando el kit Amicon Ultra Filter® (Millipore UFC901008) y se confirmaron en un gel de agarosa al 1% para verificar su presencia y calidad.

2.7. Identificación de las especies de Mycobacterium

Los productos amplificados del gen 16S rRNA se enviaron al Servicio de Secuenciación de Macrogen, Maryland, Estados Unidos. Las secuencias obtenidas se analizaron y corrigieron utilizando el programa BioEdit . Se construyeron secuencias de consenso a partir de los fragmentos directos e inversos, que se compararon con las secuencias depositadas previamente en el GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando el programa BLAST y EzTaxon 2.1 .

2.8. Análisis filogenético

Se obtuvieron las secuencias del gen 16S rRNA para las siguientes especies de micobacterias de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSM): M. neoaurum ATCC25795, M. parafortuitum DSM43528, M. moriokaense , y M. confluentis . Las secuencias de las cepas de la colección y las de las cepas aisladas en la presente investigación se alinearon con el programa BioEdit . El análisis filogenético se realizó mediante el método de máxima parsimonia en el software MEGA versión 4 . Para formar la raíz del cladograma se utilizó la secuencia de Pantoea agglomerans DSM 3493.

3. Resultados

Las 108 cepas aisladas de las 103 muestras recogidas se distribuyeron en 13 grupos según sus características morfológicas macroscópicas y microscópicas (Tabla 2). Los grupos 11 y 12, en particular, estaban compuestos por cepas acidorresistentes.

Grupo Número de cepas Características morfológicas Molecular (bp)
Macroscópicas Microscópicas 23S rRNA
Pigmentación Aparición Ziehl-Neelsen
1 29 Amarillo Crema – 250
2 10 Blanco Crema – 250
3 14 Blanco Seco – 250
4 2 Salmón Crema – 250
5 2 Salmón Seco – 250
6 2 Blanco, oscuro Crema – 250
7 2 Blanco Crema – 250
8 3 Blanco, oscuro Seco – 250
9 4 Blanco Seco – 250
10 10 Blanco Crema, seco – 250
11 10 Blanco Seco + 350 y 250
12 7 Amarillo Crema + 350
13 13 Blanco Seca – 250
-: ausencia de bacilos acidófilos; +: presencia de bacilos acidófilos; Bp: pares de bases.
Tabla 2
Las cepas aisladas se agrupan en función de sus características morfológicas y de la presencia del marcador molecular (100 pb) en el gen del ARNr 23S.

Para la identificación a nivel de especie, se eligieron 39 cepas: 10 de ellas pertenecían al grupo 11 y 7 al grupo 12. Se seleccionaron dos cepas de cada uno de los 11 grupos restantes para completar las 39 cepas. El marcador molecular de 100 pb se encontró en el 33% (13/39) de las cepas seleccionadas. Para ellas, se amplificó el gen 16S rRNA para su secuenciación e identificación a nivel de especie.

La prevalencia global de MNT en las muestras recogidas fue del 12,6% (13/103) considerando tanto las muestras de leche como las de exudado nasal. Sin embargo, la prevalencia específica para las muestras de exudado nasal fue del 19,1% (13/68).

De acuerdo con la comparación de secuencias, se identificaron cuatro especies de MNT del género Mycobacterium; el 64% (6/13) de las cepas tenían un 98% y un 99% de similitudes con M. neoaurum, mientras que el 31% (4/13) tenían un 99% de similitud con M. parafortuitum, el 15% (2/13) tenían similitudes del 98% y el 99% con M. moriokaense y, por último, el 8% (1/13) tenían un 99% de similitud con M. confluentis (Tabla 3).

Estrato Origen del rebaño Medio de cultivo Amplificado tamaño del fragmento (pb) Similaridad (Blast) % Similaridad (EzTaxon) %
1-AZ 2 Middlebrook 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.3
2-AZ 2 Stonebrink 1408 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.1
3-AZ 2 Stonebrink 1428 M. neoaurum 98 M. neoaurum 98.2
5-AZ 3 Stonebrink 1416 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.2
8-AZ 4 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.0
12-AZ 2 Middlebrook 1415 M. neoaurum 99 M. neoaurum 99.4
4-AZ 4 Middlebrook-P 1420 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
9-AZ 3 Middlebrook 1415 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.9
10-AZ 4 Stonebrink 1411 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.4
11-AZ 3 Stonebrink 1414 M. parafortuitum 99 M. parafortuitum 98.2
6-AZ 2 Stonebrink 1455 M. moriokaense 99 M. moriokaense 98.2
13-AZ 4 Stonebrink 1417 M. moriokaense 98 M. moriokaense 98.2
7-AZ 2 Middlebrook-P 1420 M. confluentis 99 M. confluentis 99.1
2: Zacazonapan Holstein-F; 3: Zacazonapan Holstein-F; 4: Zacazonapan Holstein-F.
Tabla 3
Comparación de las secuencias del gen del ARNr 16S de las cepas aisladas de bovinos con las documentadas en GenBank, utilizando BLAST y EzTaxon.

Se formó el árbol filogenético con el género Mycobacterium y cuatro de sus especies mediante el cual se observaron las relaciones filogenéticas entre las cepas de colección y las cepas aisladas en la presente investigación (Figura 1).

Figura 1
Árbol filogenético construido mediante la comparación de las secuencias del gen 16S rRNA de las cepas aisladas y de referencia.

4. Discusión

Las especies de MNT se aislaron únicamente de muestras de exudado nasal, lo que eliminó las muestras de una de las granjas locales de este estudio (Tabla 1). Encontramos que la prevalencia específica fue de 19.1% en hatos de la región sur del Estado de México. Estudios similares en Estados Unidos, Sudáfrica, Tanzania y Brasil reportaron valores de prevalencia de MNT de 3.4%, 24.5%, 7% y 7.8%, respectivamente; por lo tanto, el valor de prevalencia encontrado en este estudio se encuentra dentro del rango reportado previamente. En este estudio, 13 de las 39 cepas analizadas se identificaron como las especies de MNT M. neoaurum, M. moriokaense, M. confluentis y M. parafortuitum.

M. neoaurum, miembro del complejo Mycobacterium parafortuitum, es responsable de un amplio espectro de enfermedades, la mayoría de ellas infecciones relacionadas con dispositivos como catéteres Hickman, catéteres BROVIAC, líneas PICC , fístula arteriovenosa que incluía un injerto de politetrafluoroetileno , marcapasos y endocarditis de válvulas protésicas . Los pacientes inmunocomprometidos que sostienen estos dispositivos son los principales huéspedes, por ejemplo, los pacientes que padecen cáncer y los diabéticos con insuficiencia renal y problemas cardíacos . También se ha aislado M. neoaurum en pacientes con infecciones urinarias , meningoencefalitis y alteraciones del sistema nervioso central , bacteriemia y endocarditis , e infección pulmonar . Aunque se ha aislado principalmente de casos clínicos, también hay informes sobre su aislamiento en la leche y el ganado.

M. moriokaense se aisló de una muestra de esputo . Aunque se considera no patógeno para el ser humano, se ha asociado con enfermedades pulmonares . También se aisló M. confluentis de muestras de esputo y, junto con M. parafortuitum, ambas se consideran especies no patógenas. M. confluentis, M. moriokaense y M. neoaurum se han aislado de diferentes tejidos bovinos y silvestres con lesiones tuberculosas, mientras que M. parafortuitum sólo se ha aislado de leche bovina . Sin embargo, en nuestro trabajo, M. parafortuitum sólo se aisló de muestras de exudado nasal.

Los requerimientos nutricionales de las micobacterias difieren entre las distintas especies, lo que motivó la utilización de diferentes medios de cultivo. En particular, siete de las 13 cepas identificadas en este estudio se aislaron en el medio Stonebrink, incluidas M. neoaurum, M. parafortuitum y M. moriokaense. Este resultado concuerda con lo descrito por Sepúlveda et al. quienes indicaron que el medio Stonebrink es adecuado para la recuperación de diferentes especies del género Mycobacterium. García-Martos y García-Agudo informaron de que el medio Middlebrook es óptimo para el aislamiento de actinomicetos, lo que concuerda con la presente investigación teniendo en cuenta que en este medio se aislaron dos especies, M. neoaurum y M. parafortuitum. En particular, M. confluentis sólo se aisló en el medio Middlebrook suplementado con piruvato sódico; por lo tanto, la estrategia de utilizar diferentes medios de cultivo fue adecuada porque permitió aislar diferentes especies del género Mycobacterium.

La detección del marcador molecular presente en el gen 23S rRNA de las bacterias Gram-positivas con contenido de HGC permitió discriminar entre cepas de eubacterias y micobacterias. El análisis de secuenciación del gen 16S rRNA posibilitó la identificación a nivel de especie; por tanto, la combinación de estas metodologías es adecuada para la identificación de especies de MNT.

5. Conclusiones

Usando la metodología descrita en este estudio, se aislaron e identificaron cuatro especies de NTM: M. confluentis, M. moriokaense, M. neoaurum y M. parafortuitum. Estas especies fueron aisladas por primera vez en exudados nasales de bovinos de la región sur del Estado de México. Tres de las especies identificadas (M. neoaurum, M. moriokaense y M. confluentis) son de importancia en salud pública y veterinaria.

Divulgación

Este trabajo se deriva de la tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias de la Salud (Universidad Autónoma del Estado de México), registrada en el PNPC-CONACYT.

Conflictos de interés

Todos los autores declaran no tener conflictos de interés.

Agradecimientos

Los autores agradecen la ayuda financiera de la Secretaría de Investigación y Estudios Avanzados de la Universidad Autónoma del Estado de México (UAEMex) a través de las siguientes becas de investigación: (i) «Implementación de Sistemas de Información Geográfica y Técnicas de Biología Molecular, como herramientas en la detección e identificación de Mycobacterium spp.», SIEA-UAEM 3486/2013CHT, y (ii) la red «Microbiología y química en las Ciencias de la Salud», 039/2014RIF.