Materiales

La duloxetina (DLX) de grado puro fue amablemente proporcionada como muestras de regalo por Lupin Pharmaceuticals, Mumbai, India. Los grados de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) 100 M, 4CM y 15 M CR fueron proporcionados generosamente por Panacea Biotech Limited, R&D Center, Lalru, Punjab, India. Todos los demás productos químicos de laboratorio y reactivos utilizados en el estudio eran de grado reactivo analítico. Se utilizó agua bidestilada durante todo el estudio. El polietilenglicol 400 se compró a S.D. Fine Chem Ltd., Boisar, India. El hidrogenofosfato disódico, el dihidrogenofosfato de potasio y el hidróxido de sodio se compraron a CDH Ltd., Nueva Delhi, India. El etanol absoluto se obtuvo de Changshu Yangyuan Chemical, China. El n-Octanol se adquirió de E-Merck (India) Ltd., Mumbai, India. La membrana de diálisis150 se compró a Hi Media Laboratories Ltd., Mumbai. Todos los materiales y polvos se almacenaron al vacío a temperatura ambiente.

Equipos

Los espectros UV se registraron en el espectrofotómetro UV/visible Perkin Elmer lambda 15 en el rango UV/visible de 190 a 600 nm. El conjunto de celdas de difusión Franz se adquirió en Permegear, Inc. El espectrofotómetro infrarrojo FT-IR-8300 se obtuvo del espectrofotómetro FTIR PE RX 1 de Perkin Elmer. Los espectros de calorimetría diferencial de barrido (DSC) se obtuvieron utilizando el modelo DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). La centrífuga de investigación era de REMI Equipments, Mumbai, India. El medidor de pH CyberScan pH 510 se adquirió de Eutech Instruments, India.

Estudios de preformulación

Preparación de solución salina tamponada con fosfato pH 7.4

Se disolvieron 0,19 g de dihidrogenofosfato de potasio, 2,38 g de hidrogenoortofosfato de disodio y 8,0 g de NaCl en agua destilada y se completó el volumen hasta 1000 ml con agua destilada. El pH del tampón se ajustó a 7,4.

Cuantificación del clorhidrato de duloxetina

El contenido de duloxetina se analizó mediante análisis espectrofotométrico UV en solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4. El barrido de la solución madre se realizó en el rango UV de 190 a 400 nm. La λ max se obtuvo a la longitud de onda de 289 nm. La solución madre A (250 μ/ml) de clorhidrato de duloxetina se preparó disolviendo 0,0250 g del fármaco en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) en 100 ml. Además, se prepararon diluciones en serie que iban de 1 μg/ml a 100 μg/ml de duloxetina mediante la dilución de las soluciones madre A y B con tampón fosfato (pH 7,4). Los valores de absorbencia de las diluciones se anotaron a λ max de DLX, es decir 289 nm frente a la solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) tomada como blanco, y se trazó la curva de calibración.

Caracterización fisicoquímica del clorhidrato de duloxetina

Determinación del punto de fusión

Se tomó una pequeña cantidad de clorhidrato de duloxetina en un tubo capilar (fundido en un extremo) y se colocó en el aparato de punto de fusión, y se registró la temperatura de fusión. Se realizaron tres mediciones separadas con este fin y se obtuvo su valor medio.

Determinación del coeficiente de partición

El coeficiente de partición del clorhidrato de duloxetina se determinó en el sistema octanol-agua (Wells 2002). Las dos fases se tomaron en proporción 1:1 v/v y se saturaron mutuamente en un agitador de baño de agua a 37 °C, y luego se separaron las dos fases. Se añadieron diez miligramos del fármaco a una mezcla de 20 ml de fase orgánica presaturada y 20 ml de agua presaturada y se agitó durante 10 minutos. A continuación, los frascos se mantuvieron a 37 °C durante 24 horas con agitación intermitente. Posteriormente se centrifugó la mezcla para separar las fases acuosa y no acuosa. Las dos fases se analizaron por separado en busca de duloxetina por espectrofotometría. A continuación se calculó el coeficiente de partición del fármaco «K o/w» a partir de la relación de la concentración del fármaco en el octanol y en la fase acuosa.

Estudios de interacción fármaco-polímero

Espectroscopia de infrarrojos con transformación de Fourier

Se empleó la espectroscopia de infrarrojos con transformación de Fourier (FTIR) para analizar el fármaco puro DLX, la mezcla física de DLX y HPMC (15 CR, 100 M y 4 M), así como los parches transdérmicos cargados con el fármaco empleando el método de gránulos KBr. Todas las muestras se escanearon de 400 a 4000 cm-1.

Calorimetría diferencial de barrido

Las posibles interacciones entre el fármaco y el polímero utilizado se analizaron a partir de los termogramas DSC del clorhidrato de duloxetina puro y de la formulación (HPMC + fármaco) obtenidos utilizando el modelo DSC Q20 V24.2 Build 107 (Universal V4.5A TA Instruments). Todas las muestras se sellaron en ollas de aluminio de fondo plano y se calentaron en un rango de temperatura de 25 a 300 °C a una tasa de incremento de 5 °C/min.

Fabricación de parches transdérmicos

Las películas transdérmicas que contenían clorhidrato de duloxetina se fundieron en portaobjetos de vidrio mediante el método de evaporación de disolventes utilizando diferentes grados (K 15 M CR, K 4CM, K 100 M) de HPMC en presencia y ausencia de un plastificante. Se utilizó PEG 400 (5%) como plastificante en todos los casos. La tabla 1 muestra las fórmulas y la composición de los diferentes tipos de parches formulados. El clorhidrato de duloxetina (60 mg) se disolvió en una mezcla de disolventes de agua y metanol (7:3). La matriz del fármaco se preparó disolviendo concentraciones variables (1% y 1,5% p/v) de HPMC en el mismo sistema de disolventes. La solución se mantuvo inalterada durante 24 h. A continuación, con la ayuda de una jeringa y una aguja, se vertió la solución en un anillo de vidrio de 5,0 cm de diámetro colocado en la superficie del vidrio. Se dejó evaporar el disolvente durante 6 h en un horno con control termostático a 60 °C. Los parches se almacenaron en un recipiente hermético en condiciones ambientales durante 7 días antes de su uso.

Tabla 1 Fórmulas y composición de los sistemas transdérmicos formulados de duloxetina HCl

Evaluación de los parches transdérmicos

Aspecto físico

Todos los parches preparados se inspeccionaron visualmente para comprobar su color, claridad, flexibilidad y suavidad.

Espesor del parche

El espesor de los parches cargados con el fármaco se midió utilizando un micrómetro de tornillo en tres puntos diferentes de los parches. Se calcularon los valores medios y la desviación estándar de las tres lecturas para cada parche cargado de fármaco.

Uniformidad de peso

Los parches se sometieron a la prueba de variación de peso pesando todos los parches en una máquina de pesaje digital. Las determinaciones se realizaron por triplicado para cada formulación. A continuación, se calcularon los valores de peso medio y desviación estándar.

Estudio de planeidad

El estudio de planeidad se llevó a cabo para evaluar que los parches transdérmicos preparados poseyeran una superficie lisa y no se contrajeran con el tiempo. Se cortaron tres tiras longitudinales de la película en tres porciones diferentes. Se midió la longitud de cada tira y la variación de la longitud debida a la falta de uniformidad en la planicidad mediante la determinación del porcentaje de constricción, siendo el 0% de constricción equivalente al 100% de planicidad. El porcentaje de constricción se obtuvo como (l 1 – l 2)/l 1 × 100. Aquí, l 1 es la longitud inicial de cada tira, y l 2 es la longitud final de cada tira.

Resistencia de plegado

Este ensayo se realizó para comprobar la eficacia del plastificante y la resistencia del parche preparado utilizando diferentes polímeros. La resistencia al plegado se define como el número de pliegues necesarios para romper cualquier parche polimérico. La resistencia al plegado se midió manualmente doblando repetidamente una pequeña tira de la película (2 × 2 cm) en el mismo lugar hasta que se rompiera. El número de veces que el parche podía doblarse en el mismo lugar sin romperse/agrietarse daba el valor de la resistencia al plegado. Se tomaron tres parches de cada tipo para la prueba.

Porcentaje de absorción de humedad/absorción de vapor de agua

La prueba del porcentaje de absorción de humedad se realizó para comprobar la estabilidad física y la integridad de las películas en condiciones de alta humedad. Las películas preparadas (3,14 cm2) se pesaron individualmente con precisión y se expusieron al 85 ± 5% de humedad relativa en un desecador que contenía 100 ml de solución saturada de cloruro de potasio a temperatura ambiente. Durante este periodo, las películas se pesaron a intervalos de tiempo regulares de 24, 48 y 72 h. El porcentaje de absorción de humedad se determinó a partir de la siguiente fórmula:

Contenido porcentual de humedad

Esta prueba también se realizó para comprobar la integridad de las películas en condiciones de sequedad. Las películas transdérmicas individuales (de área especificada) se mantuvieron en un desecador que contenía cloruro de calcio anhidro fundido a temperatura ambiente. Durante este periodo, las películas se pesaron a intervalos regulares de 24, 48 y 72 h. El porcentaje de humedad se determinó mediante la siguiente fórmula:

Transmisión de vapor de agua

La tasa de transmisión de vapor de agua (WVTR) se define como la cantidad de humedad transmitida a través de la unidad de superficie de la película en la unidad de tiempo. Se utilizaron viales de vidrio de igual volumen y diámetro como celdas de transmisión. Las cubetas se lavaron adecuadamente y se secaron en el horno. A continuación, se colocó en cada vial aproximadamente 1 g de cloruro cálcico fundido anhidro y se fijó el parche sobre el borde del vial con la ayuda de una cinta adhesiva. A continuación se pesaron estos viales y se colocaron en desecadores que contenían una solución saturada de cloruro de potasio para mantener una humedad relativa del 84%. Estas células se sacaron de los desecadores y se pesaron después del primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo día. La tasa de transmisión de vapor de agua se determinó de la siguiente manera:

$$ W.\NV.\NT. = WL/S $$

Donde W es el peso de los vapores de agua transmitidos, L es el espesor del parche y S es la superficie expuesta en centímetros cuadrados.

PH de la superficie

Los parches se mantuvieron en contacto con 0,5 ml de agua destilada doble durante 1 hora en tubos de vidrio y se dejaron hinchar. Se acercó un electrodo de vidrio combinado a la superficie del parche y se tomaron lecturas del pH después de permitir un período de equilibrio de 1 minuto.

Determinación del contenido del fármaco

Se cortaron piezas de tamaño 2 × 2 de cada tipo de formulación y se pusieron en 100 ml de solución salina tamponada con fosfato de pH 7,4. El contenido se agitó magnéticamente durante 2 h. A continuación, la solución se filtró a través de papel de filtro Whatman (0,45 μ) y se diluyó convenientemente con solución salina amortiguadora de fosfatos de pH 7,4. A continuación, se analizó la absorbencia de la solución a 289 nm utilizando el parche de placebo como blanco. A partir de los valores de absorbancia, se determinó el contenido de fármaco.

Liberación in vitro del fármaco

Se empleó la célula de difusión de Franz para la caracterización in vitro de las formulaciones transdérmicas. Se trata de un método fiable para la predicción del transporte de fármacos a través de la piel a partir de formulaciones tópicas. El compartimento receptor de la célula de difusión se llenó con 30,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4), y se llevaron a cabo estudios de liberación de fármacos in vitro utilizando una membrana de celofán sintético. Las formulaciones preparadas se aplicaron sobre la membrana en el compartimento donante y se extendieron uniformemente sobre la membrana de celofán. El montaje se mantuvo constantemente a 37,0 ± 2,0 °C a 50 rpm. A continuación, se extrajeron muestras (alícuotas de 1,0 ml) a intervalos de tiempo adecuados (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 6, 12 y 24 h) y se rellenaron con una cantidad de medio para mantener el volumen de la fase receptora en 30 ml. Las muestras se analizaron espectrofotométricamente a 289 nm.

Estudios de permeación de fármacos/ex vivo

Los estudios de permeación de fármacos se realizaron utilizando la piel de ratas Wistar macho. Las ratas fueron sacrificadas por dislocación espinal. Las muestras de piel se cortaron, se extrajeron y se lavaron con solución salina normal. La grasa y el tejido conectivo adheridos se retiraron con unas pinzas de punta roma. La piel se mantuvo en solución salina normal durante 6 h. Los pelos de la piel de la rata se afeitaron cuidadosamente para evitar daños periféricos. El compartimento receptor de la célula de difusión de Franz se llenó con 30 ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Las formulaciones preparadas se aplicaron sobre la piel de la rata en el compartimento receptor. La temperatura del conjunto se mantuvo constantemente a 37 ± 2 °C y la velocidad de agitación se controló a 50 rpm. Las muestras (alícuotas de 5 ml) se retiraron a intervalos de tiempo adecuados (0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 y 24 h) y se sustituyeron por la misma cantidad de medio para mantener el volumen de la fase receptora en 30 ml. Las muestras se analizaron espectrofotométricamente a λ max de 289 nm.

Estudios de irritación de la piel

Se obtuvo la autorización ética para el manejo de los animales de experimentación por parte del Comité Ético Institucional de Animales (IAEC), de la Universidad de Panjab, Chandigarh, y los estudios se llevaron a cabo según el protocolo aprobado.

Las ratas albinas Wistar se alojaron en jaulas, con exceso libre de dieta estándar de laboratorio y agua. La piel abdominal dorsal de las ratas se afeitó con cuidado para evitar daños periféricos, antes de las 24 horas de realizar el estudio. Se aplicó un parche transdérmico sobre la piel desnuda y se cubrió con una cinta microporosa no sensibilizante. Se aplicó una solución acuosa de formalina al 0,8% v/v como irritante cutáneo estándar. A los animales se les aplicó un nuevo parche cada día hasta los 7 días. La formulación se retiró después de 7 días; se registró la puntuación del eritema y se comparó con el estándar. La puntuación del eritema se leyó y registró mediante el método de puntuación de Draize (Draize et al. 1944) como puntuación 0 para ausencia de eritema, puntuación 1 para eritema muy leve (rosa claro), puntuación 2 para eritema bien definido (rosa oscuro), puntuación 3 para eritema de moderado a grave (rojo claro) y puntuación 4 para eritema grave (rojo oscuro).

Análisis de datos

Para la enésima muestra, V s es el volumen de muestra extraído, V t es el volumen total del medio receptor, C c es la concentración corregida, C u es la concentración no corregida de la enésima muestra y C i es la concentración no corregida. Además, la concentración corregida se utilizó para calcular los valores de la cantidad de fármaco liberado y el porcentaje de fármaco liberado en cada momento del muestreo junto con la tasa de liberación del fármaco.

El coeficiente de permeabilidad es la velocidad de paso del fármaco a través de la membrana/piel en μg/cm2/h. El coeficiente de permeabilidad se calculó a partir de la pendiente de la gráfica del porcentaje de fármaco transportado frente al tiempo como P = pendiente × V d/S

Aquí, V d es el volumen de la solución donante en mililitros, y S es la superficie del tejido en centímetros cuadrados.

El flujo (valor J) se define como la cantidad de material que fluye a través de una barrera de sección transversal unitaria en tiempo unitario. Se calcula mediante: