Definición de unidad
Una unidad de actividad de endonucleasa de restricción se define como la cantidad de enzima necesaria para producir una digestión completa de 1 µg de ADN de sustrato (o fragmentos) en un volumen de reacción total de 50 µl en 60 minutos en las condiciones de ensayo óptimas indicadas para cada endonucleasa de restricción.
Determinación de la actividad volumétrica de las endonucleasas de restricción
Los ensayos de actividad de las endonucleasas de restricción se realizan añadiendo diferentes diluciones de enzima al tampón de ensayo apropiado que contiene 1 µg de ADN de sustrato. Tras una incubación de 60 minutos a la temperatura adecuada, se detiene la digestión y las muestras de ADN se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa/bromuro de etidio. La solución enzimática más diluida que da una digestión completa se utiliza para calcular la actividad en unidades/µl.
Tenga en cuenta que la actividad depende del sustrato y que cuando se trabaja con un sustrato nuevo, la enzima debe valorarse para determinar la actividad real o esperada.
Controles de calidad
Los resultados de todos los ensayos de control de calidad se indican en la ficha técnica que se suministra con cada enzima.
Asayo de sobredigestión
Se utilizó un ensayo de sobredigestión como determinación cualitativa de la pureza de la enzima y de la ausencia de DNasas no específicas. En el ensayo de sobredigestión, se añaden cantidades crecientes de cada endonucleasa de restricción (normalmente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) a una serie de tubos que contienen 1 µg de ADN de sustrato. Tras una incubación de 20 horas en las condiciones de ensayo recomendadas, se determina el número máximo de unidades que dan un patrón de bandas claro, nítido y normal mediante electroforesis en gel de agarosa/bromuro de etidio.
Para superar la prueba, la enzima debe producir un patrón de bandas inalterado en condiciones de sobredigestión de hasta 600 veces (unidades x horas) en comparación con una digestión de 2 veces. Si la enzima presenta una actividad «en estrella» a un exceso funcional inferior a 600 veces, la descripción del producto incluye información sobre el exceso funcional en el que no se produce la actividad «en estrella».
Ensayo de endonucleasas inespecíficas
Para ensayar la contaminación por endonucleasas inespecíficas, cada endonucleasa de restricción se incuba con un sustrato de plásmido superenrollado que carece de la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción. Una sola mella inespecífica en el ADN RF I lo convierte en la forma RF II (círculo mellado). Se añaden cantidades crecientes de enzima (normalmente 10, 20, 30, 40, 50 unidades) a una serie de tubos que contienen 1 µg de ADN RF I (forma superenrollada). Tras una incubación de 20 horas en las condiciones de ensayo recomendadas, se distinguen las dos formas en geles de agarosa y se determina el porcentaje de conversión de RF I a RF II.
Ensayo de ligación y recortado
Se utilizó un ensayo de ligación para determinar la pureza funcional del ADN tras la digestión con enzimas de restricción. El ADN del sustrato se digiere completamente con un exceso de 10 y 50 veces de la endonucleasa de restricción en el tampón de ensayo apropiado, se liga con la ligasa de ADN T4 y se vuelve a cortar con la misma enzima de restricción. Los ADNs cortados, ligados y recortados se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa/bromuro de etidio. Un patrón de bandas normal indica que los terminales 5 y 3 están intactos, así como la ausencia de nucleasas o fosfatasas contaminantes.
Estabilidad
Todas las endonucleasas de restricción de Jena Bioscience se vuelven a analizar cada 4-6 meses. Este proceso nos permite asegurar una actividad enzimática completa y un rendimiento óptimo en cada enzima que enviamos. Debido a los excelentes resultados de estas pruebas, hemos ampliado las fechas de caducidad de la mayoría de nuestras enzimas a 18 meses.