Ensayos radiométricos de unión de ligandos | Base de conocimientos de soporte de aplicaciones | Productos y servicios de laboratorio | PerkinElmer

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Resumen

Los ligandos radiactivos se utilizan habitualmente para medir la unión de ligandos a receptores. En este ensayo, usted medirá la unión de un ligando radiomarcado a células o membranas celulares que contienen un receptor de interés. Para este ensayo se pueden utilizar tanto células enteras como membranas celulares. Los radioligandos pueden utilizarse para realizar curvas de saturación, competencia y experimentos cinéticos.

Unión ligando-receptor

Al seleccionar un radioligando, hay algunos factores que deben tenerse en cuenta:

• Alta actividad específica: Los radioligandos con una alta actividad específica son adecuados para los ensayos de unión de ligandos. La actividad específica indica la cantidad de radiactividad que hay por molécula de ligando, y se suele indicar en unidades de Curies por milímetro de ligando. Varios de nuestros ligandos marcados con 125I se ofrecen con la máxima actividad específica (2200 Ci/mmol si se dispone de un sitio de marcado con 125I, 4400 Ci/mmol si se dispone de dos sitios de marcado con 125I, etc.). Esto indica que prácticamente cada molécula de ligando proporcionada en el vial de reserva está radiomarcada. Para los ligandos tritiados (ligandos 3H), lo ideal es elegir un ligando que tenga una actividad específica superior a 20 Ci/mmol. La máxima actividad específica teórica por tritio es de 29 Ci/mmol (Curies por milimol de tritio). Las actividades específicas por encima de este valor indican que, en promedio, cada molécula de ligando tiene al menos un tritio.
• Baja unión no específica: Los ligandos hidrofóbicos generalmente mostrarán una mayor unión no específica. Esto puede compensarse a veces recubriendo los filtros con BSA para reducir la unión no específica. La inclusión de BSA, sales o detergentes en el tampón de lavado o de unión también puede ayudar a reducir la unión no específica. Si el radioquímico de reserva está envasado en un vial silanizado (consulte la hoja de datos técnicos), esto puede indicar que el ligando es algo hidrofóbico
• Alta pureza: Lo ideal es que el ligando tenga una pureza radioquímica superior al 90%. La pureza radioquímica disminuye con el tiempo, y la tasa real de esta degradación se acelera con el tiempo. La pureza radioquímica y las tasas de degradación de nuestros diversos radioquímicos pueden encontrarse en las hojas de datos técnicos específicas de cada lote.
• Alta selectividad: Cuanto más selectivo sea el ligando para su receptor, mejores serán sus datos. Una alta selectividad indica que el ligando será reconocido principalmente por un solo receptor de interés, por encima de otros receptores que puedan estar presentes en una membrana celular. Además, el uso de membranas que sobreexpresan el receptor de interés puede ayudar a reducir cualquier contribución potencial de los receptores expresados endógenamente en la membrana.
• Estabilidad: Si va a necesitar utilizar su radioligando durante un período de tiempo prolongado, la estabilidad puede ser un factor para usted. Los ligandos marcados con 125I deben utilizarse generalmente en un plazo de uno a dos meses a partir de la fecha de fabricación. Los ligandos tritiados deben utilizarse normalmente en un plazo de 3 a 6 meses a partir de la fecha de fabricación; sin embargo, hay excepciones a esto. Las tasas de degradación y las fechas de fabricación se pueden encontrar en nuestras hojas de datos técnicos específicas de cada lote. También puede ponerse en contacto con el servicio de asistencia técnica para discutir el tiempo de uso recomendado para cada radioquímico de PerkinElmer; nuestra información de contacto se encuentra en la esquina superior derecha de esta página.
• Energía: el 3H libera energía beta, que puede medirse en un contador de centelleo tras la adición de centelleo (en forma de cóctel de centelleo, centelleo sólido Meltilex®, una perla SPA, etc.). La energía beta interactúa con el centellador para producir fotones, que son medidos por el detector. El 125I libera tanto energía beta como energía gamma. Si sólo tiene acceso a un contador gamma, debe utilizar un radioligando marcado con 125I. Un factor adicional es el formato del ensayo. El 125I emite más energía beta que el 3H. Para los ensayos de SPA, pueden utilizarse eficazmente ligandos marcados con 3H o 125I.

Los ensayos de unión de ligandos radiactivos pueden realizarse en varios formatos diferentes. Normalmente, realizamos este ensayo en formato de filtración, pero el ensayo también puede realizarse en formato SPA. El formato SPA es un formato homogéneo, lo que significa que no se requieren pasos de lavado. En el ensayo de filtración, se lavará el ligando no unido utilizando un colector de vacío o un recolector de células.

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Formatos de ensayo

Ensayos de unión de ligandos por filtración

Vea más información sobre los materiales que necesita, las optimizaciones que puede necesitar realizar y las referencias para ensayos de unión de ligandos radiactivos en placa de filtro. En el formato de filtración, el ensayo de unión se lleva a cabo primero en una placa de ensayo y luego se filtra a través de una placa filtermat o UniFilter® utilizando un recolector de células (colector de vacío). Los filtros se lavan para eliminar cualquier radioligando no unido. La placa filtermat o UniFilter se seca y se añade el cóctel de centelleo (o Meltilex®) antes de la lectura en un detector apropiado.

Ensayos de unión de ligandos SPA

Vea más información sobre qué materiales necesita, qué optimizaciones puede necesitar realizar y referencias para los ensayos de unión de radioligandos SPA. En el formato SPA, las membranas celulares se capturan en perlas SPA. Cuando el radioligando se une al receptor/membrana, esto pone el radioquímico en la proximidad de la perla SPA. La energía beta del radioligando puede interactuar con el centelleo en la perla, produciendo una señal que puede ser medida. El radioligando que no está unido a la membrana celular no estará lo suficientemente cerca de la perla SPA para interactuar fuertemente con el centelleo.

Resumen de la unión del ligando

Definiciones

• Afinidad (potencia): la firmeza con la que el ligando se une al receptor. Suele expresarse como una constante de equilibrio, Kd. Cuanto menor sea el valor de Kd, mayor será la afinidad.
• Especificidad: describe lo selectivo que es un ligando para un receptor frente a otros receptores similares
• Kd: La concentración en la que el 50% de los receptores son ocupados por el radioligando

Clasificaciones farmacológicas para ligandos

Ligandos

• Agonista completo: ligando que se une y activa un receptor y desencadena una respuesta máxima
• Agonista parcial: ligando que se une a un receptor y produce una respuesta submáxima
• Antagonista: ligando que se une a un receptor y no lo activa. Los antagonistas no provocan ninguna respuesta cuando se aplican solos. Bloquearán los efectos de un ligando agonista competidor.
• Agonista inverso: un ligando que se une a un receptor y disminuye la respuesta por debajo del nivel basal

Ensayos

I. Experimento de saturación: Mide el equilibrio de unión realizando una titulación del radioligando, manteniendo constante la cantidad de receptor.

Puede utilizar las curvas de saturación para determinar Bmax (nivel de expresión del receptor) y Kd (afinidad de unión del ligando).

Experimento de saturación

• Unión total: Aumento de la concentración del radioligando en ausencia del ligando en frío. Mide tanto la unión específica al receptor como la no específica.
• Unión no específica: Concentración creciente del radioligando en presencia del ligando frío. Mide la unión del radioligando a componentes no receptores.
• Unión específica: Unión total menos la no específica. Mide la unión al receptor, específicamente.

II. Experimento de competencia: Mide la unión de equilibrio de una única concentración de radioligando en presencia de varias concentraciones de competidor no marcado.

Se pueden utilizar curvas de competencia para determinar la afinidad de un gran número de compuestos no marcados por un receptor en el cribado. El IC50 y el Ki pueden derivarse de los datos de competencia.

Curva de competencia

• IC50: Concentración de un ligando competidor que desplaza la mitad del ligando radioligante
• Ki: afinidad de un ligando frío por el receptor

Nota: Al cambiar la concentración del radioligando, se puede observar un desplazamiento del IC50 de un compuesto de referencia; sin embargo, el Ki permanece igual.

III. Experimentos cinéticos: Medir el nivel de unión en varios momentos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación del radioligando.

Cinética

• Concentración saturante de ligando añadida una cantidad unida a lo largo del tiempo para determinar la Kon
• Alta concentración de competidor no marcado añadida y disminución de la unión con el tiempo medido para determinar el Koff

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Consejos y preguntas frecuentes

Por supuesto, querrá seleccionar un radioligando que tenga las siguientes propiedades:

• Alta actividad específica (> 20 Ci/mmol para un ligando tritiado)
• Baja unión no específica (los ligandos hidrofóbicos generalmente mostrarán una mayor unión no específica)
• Alta pureza (típicamente > 90% de pureza)
• Alta selectividad
• Estabilidad (si va a necesitar utilizar su radioligando durante un período prolongado de tiempo, la estabilidad puede ser un factor. Los ligandos marcados con 125I deben utilizarse generalmente en un plazo de uno a dos meses a partir de la fecha de fabricación. Los ligandos tritiados deben usarse generalmente dentro de los 3 a 6 meses de la fecha de fabricación (sin embargo, hay excepciones a esto).

Al trazar sus datos, recomendamos que use la concentración determinada experimentalmente de sus soluciones de trabajo de radioligandos, en lugar de una concentración calculada. Algunos radioligandos se adhieren a las paredes de los tubos de dilución. Es importante determinar la verdadera concentración de su radioligando pipeteado. Para determinar experimentalmente la concentración de una dilución de radioligando, pipetee unos pocos microlitros de su tubo de dilución y póngalos en un filtro. Es posible que también quieras manchar una dilución de 1/10 de esta muestra, para que puedas cotejar tus resultados. Determina las dpms (desintegraciones por minuto). Convierta de dpms a Curies utilizando la siguiente ecuación:

1 Ci = 2,22 x 1012 dpm

Luego utilice la actividad específica de su lote de radioligando para convertir de Curies a moles. Para determinar la concentración radiactiva en este punto, divida el número de moles por el volumen que ha manchado en la esterilla.

FAQs

Q. ¿Qué concentración de radioligando debo utilizar para mi curva de saturación?
A. Generalmente recomendamos que elija 3-5 concentraciones por debajo de la Kd, y 3-5 concentraciones por encima de la Kd. La concentración más alta debería ser diez veces la Kd.

Q.¿Qué concentración de radioligando debería seleccionarse para la unión competitiva?
A. El radioligando se utiliza a una concentración baja, normalmente a su valor Kd o inferior. Si la actividad específica es baja, se puede utilizar una concentración superior al valor Kd, pero nunca debe ser igual o superior a la concentración de saturación.

Q. ¿Qué tipo de ligando debo utilizar para determinar la unión no específica en mis curvas de saturación?
A. Por lo general, querrá elegir un ligando que sea diferente a su radioligando. Usted quiere desplazar sólo la unión específica del radioligando al receptor. Debe elegir un ligando que tenga alta afinidad por el sitio de unión del receptor y baja afinidad por los sitios de unión no específicos.

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Otras tecnologías de unión de ligando al receptor de PerkinElmer

• Ensayos de unión de ligando al receptor fluorescente de DELFIA

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Radioquímicos personalizados, líneas celulares, Membranas, células congeladas y receptores

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