Efecto antigenotóxico de los extractos de Trametes spp. contra el daño del ADN en los glóbulos blancos periféricos humanos

Abstract

Las especies de Trametes se han utilizado durante miles de años en la medicina tradicional y convencional para el tratamiento de varios tipos de enfermedades. El objetivo fue evaluar los posibles efectos antigenotóxicos de los extractos de micelio y basidiocarpos de especies de Trametes seleccionadas y evaluar la dependencia de su potencial antioxidante. Las especies estudiadas fueron Trametes versicolor, T. hirsuta y T. gibbosa. Se evaluaron los potenciales antigenotóxicos de los extractos en los glóbulos blancos periféricos humanos con extractos de basidiocarpos y micelios de las especies. Se utilizó el ensayo del cometa alcalino para la detección de roturas de la hebra de ADN y de los sitios alcalinizantes, así como el grado de migración del ADN. El ensayo DPPH se utilizó para estimar las propiedades antioxidantes de los extractos. Los extractos del cuerpo fructífero de T. versicolor y T. gibbosa, así como los extractos de T. hirsuta, excepto el de 20,0 mg/mL, no fueron agentes genotóxicos. El extracto de T. versicolor tuvo a 5,0 mg/mL el mayor efecto antigenotóxico tanto en el pre como en el postratamiento de los leucocitos. Los extractos de micelio de las tres especies no tuvieron actividad genotóxica y sí un efecto antigenotóxico significativo contra el daño del ADN inducido por el H2O2, tanto en el pre como en el postratamiento. Los resultados sugieren que los extractos de estas tres especies podrían considerarse como fuertes agentes antigenotóxicos capaces de estimular la respuesta genoprotectora de las células.

1. Introducción

Los hongos se han utilizado durante mucho tiempo como alimento pero igualmente en la medicina tradicional tanto del mundo occidental como del oriental . A pesar de que numerosos hongos son reconocidos como alimentos saludables , su gran potencial farmacológico sigue siendo infrautilizado . Se conocen cerca de 60 especies de Trametes en todo el mundo, pero sólo unas pocas han sido analizadas por sus propiedades medicinales. Trametes versicolor (L.:Fr.) Lloyd es la especie medicinal más famosa del género. Esta especie, cuyos nombres populares son Cola de Pavo en las culturas occidentales, Yun-Zhi (seta con forma de nube) en China, o Kawaratake (seta a la orilla del río) en Japón, se ha utilizado durante miles de años en la medicina tradicional, especialmente en Asia . Según el Compendio de Materia Médica China, escrito durante la dinastía Ming, se han registrado más de 120 cepas de T. versicolor y, en la práctica medicinal tradicional china, este hongo se considera útil para eliminar toxinas, fortalecer, aumentar la energía, mejorar la función del hígado y el bazo y potenciar la respuesta inmunitaria, especialmente cuando se seca, se muele y se prepara en forma de té. Todas esas propiedades se consideraban muy útiles en la medicina popular para el uso crónico de los preparados de Trametes spp. En la medicina convencional, la especie se utiliza principalmente para el tratamiento de varios tipos de cáncer, pero también para la hepatitis crónica, la artritis reumatoide y las infecciones del tracto respiratorio, urinario y digestivo, lo que ha sido confirmado por numerosos estudios. Además, se ha informado de fuertes efectos antivirales de algunos polisacarpéptidos aislados de T. versicolor y de una importante actividad antioxidante de los extractos de cuerpos fructíferos de Trametes spp. Estos efectos se basan principalmente en la producción del polisacárido krestin (PSK) y de varios complejos polisacárido-péptido, compuestos que reducen las metástasis del cáncer y estimulan la producción de interleucina-1 en las células humanas .

La abundante presencia de radicales libres en el medio ambiente está asociada a la aparición del estrés oxidativo, que es una de las bases del envejecimiento y del inicio y progreso de diversas enfermedades y trastornos que padece y muere una gran parte de la población mundial . El ADN es más sensible al daño oxidativo que otras macromoléculas. Los daños en el ADN, como las roturas de hebra, pueden ser inducidos por diversos agentes entre los que el H2O2 produce un efecto genotóxico. Se sabe que estos daños pueden afectar a la respuesta inmunitaria no sólo en las enfermedades inflamatorias sino también en los cánceres. El ensayo del cometa es una prueba bien establecida y eficaz de alta sensibilidad que se ha utilizado para examinar los daños en el ADN y puede aplicarse para evaluar el potencial genotóxico y protector de varios productos naturales.

Una actividad genoprotectora de los extractos de hongos basada en la reducción de los daños oxidativos del ADN también puede desempeñar un papel importante en la prevención y el tratamiento de varias enfermedades y trastornos mencionados, pero muy pocos estudios hasta hoy en día la consideran como una posible herramienta de acción en diferentes terapias . Por lo tanto, el objetivo del estudio fue evaluar los efectos antigenotóxicos de los extractos de micelio y basidiocarpos de especies seleccionadas de Trametes sobre los glóbulos blancos periféricos humanos y evaluar la dependencia de su potencial antioxidante.

2. Materiales y métodos

2.1. Los cultivos de Trametes versicolor BEOFB 321, T. hirsuta BEOFB 301 y T. gibbosa BEOFB 310 se aislaron de cuerpos fructíferos recogidos en Serbia y se mantuvieron en medio de agar malta en la colección de cultivos del Instituto de Botánica de la Facultad de Biología de la Universidad de Belgrado (BEOFB).0 g L-1; NH4NO3, 2,0 g L-1; K2HPO4, 1,0 g L-1; , 0,4 g L-1; , 0,5 g L-1; extracto de levadura, 2,0 g L-1; pH 6,5) con 25 discos de micelio (Ø 0.5 cm, procedentes de un cultivo de 7 días de duración en agar malta) en matraces de 250 mL y se incubaron en un agitador rotatorio a 100 rpm, a temperatura ambiente (°C) durante 7 d. La biomasa resultante se lavó y se homogeneizó con 100,0 mL de agua destilada (dH2O) estéril en una batidora de laboratorio. La biomasa homogeneizada (30,0 mL) se utilizó para inocular 500,0 mL de medio sintético modificado (con glucosa presente a 65,0 g L-1). El cultivo sumergido se llevó a cabo en matraces de 1000 mL a temperatura ambiente en un agitador rotatorio durante 21 d. La biomasa obtenida se filtró, se lavó 3 veces con dH2O en un agitador magnético y se secó a 50°C hasta alcanzar un peso constante.

2.2. Preparación de los extractos fúngicos

El cuerpo fructífero seco y el micelio (3,0 g) se extrajeron agitando con 90,0 mL de etanol al 96% a 30°C durante 72 h. Los extractos resultantes se centrifugaron (20°C, 3000 rpm, 15 min) y los sobrenadantes se filtraron a través de papel de filtro Whatman número 4, se concentraron a presión reducida en un evaporador rotatorio (BÜCHI R-114, Suiza) a 40°C hasta sequedad, y se redisolvieron en etanol al 96% para el ensayo antioxidante o en agua para el ensayo antigenotóxico hasta una concentración inicial de 20,0 mg mL-1. El rendimiento de la extracción se expresó como porcentaje en base al peso seco.

2.3. Actividad genoprotectora

2.3.1. Sujetos

Se obtuvieron muestras de sangre total heparinizada por venopunción de tres donantes sanos menores de 25 años. Los participantes en el estudio eran no fumadores y no alcohólicos, no recibían ninguna terapia ni medicación y no tomaban suplementos dietéticos.

2.3.2. Diseño del estudio

Se estudió la genotoxicidad de todos los extractos y concentraciones (20,0, 10,0, 5,0, 2,5, 1,25, 0,625 y 0,312 mg mL-1) mediante el tratamiento de glóbulos blancos periféricos humanos a 37°C durante 30 min con el objetivo de evaluar el daño al ADN. Normalmente, se utilizan glóbulos blancos porque se obtienen de forma relativamente no invasiva, no requieren disgregación de tejidos y se comportan bien en el ensayo cometa. El tratamiento con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37°C durante 30 minutos se utilizó como control positivo y el tratamiento con 25,0 μM de H2O2 en hielo durante 15 minutos como control negativo.

Se utilizaron dos protocolos independientes para evaluar el potencial antigenotóxico de los extractos, utilizando el pretratamiento y el postratamiento con los extractos. En el pretratamiento, las células se incubaron con los extractos a 37°C durante 30 minutos, luego se lavaron con PBS y se expusieron a H2O2 durante 15 minutos. En el postratamiento, las células se trataron con H2O2 en hielo durante 15 minutos, se enjuagaron con PBS y posteriormente se trataron con las siete concentraciones de extractos a 37°C durante 30 minutos. Después de cada tratamiento, las células se lavaron con PBS. La incubación con PBS a 37°C durante 30 min fue el control negativo y el tratamiento con 25,0 μM de H2O2 en hielo durante 15 min representó el control positivo.

Se realizaron tres réplicas para cada experimento y se analizaron 100 núcleos para cada una.

2.3.3. El ensayo de electroforesis en gel de una sola célula

El ensayo cometa se realizó según lo descrito por Singh et al. . El ensayo cometa alcalino es capaz de detectar roturas de la hebra de ADN y sitios lábiles a los álcalis, y la extensión de la migración del ADN indica el grado de daño del ADN en las células.

Las muestras de sangre entera (6,0 μL) se suspendieron en agarosa de bajo punto de fusión (LMP) al 0,67% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se pipetearon en portaobjetos de vidrio sobrecongelados y recubiertos con una capa de agarosa de punto de fusión normal al 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), se extendieron con un cubreobjetos y se mantuvieron en hielo durante 5 minutos para que se solidificaran. Tras retirar suavemente los cubreobjetos, las suspensiones celulares de los portaobjetos se trataron con los extractos y el H2O2 como se ha descrito anteriormente. Tras los tratamientos, todos los portaobjetos se cubrieron con la tercera capa de agarosa LMP al 0,5% y de nuevo se dejó solidificar en hielo durante 5 minutos. Tras retirar los cubreobjetos, los portaobjetos se colocaron en una solución de lisado fría (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X100 y 10% de dimetilsulfóxido, pH 10,0 ajustado con NaOH) a 4°C durante la noche y posteriormente se sometieron a electroforesis y tinción con bromuro de etidio. Los cometas se observaron y analizaron con un microscopio Olympus ×50 (Olympus Optical Co., Gmbh Hamburg, Alemania), equipado con un dispositivo para registrar la fluorescencia a 100 aumentos. La evaluación del daño en el ADN se realizó según lo descrito por Anderson et al. A saber, las células se clasificaron a ojo en cinco categorías correspondientes a las siguientes cantidades de ADN en la cola (A) sin daños, <5%; (B) daños de bajo nivel, 5-20%; (C) daños de nivel medio, 20-40%; (D) daños de alto nivel, 40-95%; (E) daños totales, >95% (Figura 1). El análisis se realizó en 100 células seleccionadas al azar por sujeto (50 células de cada uno de los 2 portaobjetos replicados). Para obtener un análisis semicuantitativo de los datos, el daño del ADN se caracterizó como la migración del ADN por encima del 5% (clases de cometa B + C + D + E).

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2.4. Actividad antioxidante

2.4.1. DPPH- Assay

La actividad antioxidante se definió midiendo el blanqueo de la solución de metanol de color púrpura del radical estable 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo () . Los efectos de barrido se midieron espectrofotométricamente (CECIL CE 2501) a 517 nm y se calcularon utilizando la ecuación:donde es la absorbancia del control negativo (mezcla de reacción sin extracto) y es la absorbancia de la mezcla de reacción.

La concentración del extracto (mg de extracto/mL) que proporciona el 50% de reducción (EC50) se obtuvo por interpolación del análisis de regresión lineal. Todas las mediciones se realizaron por triplicado para el análisis estadístico. El antioxidante comercial, butilhidroxianisol (BHA), en un rango de concentración de 20,0 mg mL-1-0,02 mg mL-1, se utilizó como control positivo.

2.4.2. Determinación del contenido total de fenoles

Los compuestos fenólicos totales en los extractos miceliales se estimaron con el reactivo de Folin-Ciocalteu según el método de Singleton y Rossi , utilizando ácido gálico como estándar. La concentración se determinó como μg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por mg de extracto seco, utilizando una ecuación que se obtuvo de un gráfico estándar de ácido gálico como

2.4.3. Determinación del contenido total de flavonoides

El contenido total de flavonoides se determinó por los métodos de Park et al. utilizando quercetina como estándar. La cantidad se expresó como μg de equivalentes de quercetina (QE) por mg de extracto seco, utilizando una ecuación obtenida a partir de un gráfico de hidrato de quercetina estándar como

2,5. Análisis estadístico

Los resultados se expresaron como la media ± error estándar de los datos obtenidos en tres mediciones paralelas. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía utilizando el software STATISTIKA, versión 5.0 (StatSoft Inc.) para comprobar cualquier diferencia significativa. Los valores inferiores a 0,01 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico de los datos del ensayo cometa se realizó mediante la prueba χ2 utilizando el software Statgraph 4.2. Para realizar la prueba χ2, se agruparon los resultados de los tres experimentos y se evaluó el número total de células con daños en el ADN. Una diferencia en se consideró estadísticamente significativa.

3. Resultados y discusión

3.1. Rendimiento de extracción

Los rendimientos de extracción de la biomasa del micelio para las tres especies fueron significativamente mayores en comparación con el cuerpo fructífero (). T. gibbosa tuvo el mayor rendimiento de extracción de la biomasa de micelio seca (34,6%) y el menor rendimiento de los cuerpos fructíferos secos (2,2%). El mayor rendimiento de extracción de cuerpos fructíferos, del 6,67%, se encontró en T. versicolor, cuyo rendimiento de extracción de micelio fue del 8,0%. Los rendimientos en T. hirsuta fueron del 12,0% (para el micelio) y del 2,85% (para el cuerpo fructífero). Las diferencias en la eficiencia de extracción entre las especies, tanto para el micelio como para el cuerpo fructífero, fueron estadísticamente significativas ().

Informes anteriores mostraron la dependencia de la extractabilidad de la biomasa de la especie, la cepa y el disolvente . Así, Ren et al. encontraron que los rendimientos de extracción del basidiocarpo de T. gibbosa fueron del 1,22% para el extracto de éter de petróleo, del 6,44% para el acetato de etilo y del 9,2% para los extractos de metanol. El metanol también fue un buen disolvente para el basidiocarpo de T. versicolor cuyo rendimiento osciló entre el 4,1% y el 9,16% . Basándonos en nuestros resultados, se puede concluir que los alcoholes son los mejores disolventes, pero el etanol es más débil que el metanol.

3.2. Actividad genoprotectora

Como todos los donantes de sangre gozaban de buena salud y tenían una edad similar y no estaban bajo medicación, el análisis estadístico no mostró diferencias claras en sus respuestas a los extractos. Por lo tanto, se agruparon los resultados de los tres experimentos. El tratamiento de los leucocitos de sangre periférica con H2O2 provocó una rápida y potente inducción de roturas de cadena simple en el ADN nuclear, que fue visible en el ensayo cometa como migración del ADN.

Nuestros resultados demostraron que los extractos de cuerpos fructíferos de T. versicolor de 0,312 a 20.0 mg mL-1 no causó un aumento significativo en el número total de células dañadas en el ADN en comparación con el control positivo, lo que demuestra claramente que el extracto probado no era un agente genotóxico (Figura 2(a) (A)). La distribución (valor) del daño total del ADN también fue la misma que en el control positivo. Por otra parte, estos extractos mostraron efectos protectores contra el H2O2 tanto en el pre como en el postratamiento de los leucocitos (Figura 2(a) (B, C)). El extracto a 5,0 mg mL-1 tuvo el mayor efecto y a 20,0 mg mL-1 el menor en ambos tratamientos. El valor del daño total del ADN disminuyó estadísticamente en comparación con el control positivo en todas las concentraciones ().

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El extracto de cuerpo fructífero de T. hirsuta en todas las concentraciones, excepto en la de 20,0 mg mL-1, no mostró actividad genotóxica, ya que el nivel de daños totales en el ADN no fue estadísticamente superior al del control positivo (Figura 2(b) (A)). Sin embargo, a una concentración de 20,0 mg mL-1, el efecto genotóxico y el daño total del ADN en las células fueron estadísticamente diferentes en comparación con el control positivo. En los tratamientos previos y posteriores de los leucocitos, el extracto en todas las concentraciones, excepto la más alta, mostró un efecto protector contra el daño del ADN inducido por H2O2, mostrando una disminución significativa del daño total del ADN en comparación con el control positivo (Figura 2(b) (B, C)). Estos tratamientos mostraron una correlación dependiente de la dosis, con el mayor efecto protector a una concentración de extracto de 0,312 mg mL-1, mientras que la concentración de 20 mg mL-1 no mostró ninguna protección contra los cometas inducidos por H2O2.

La ausencia de un efecto genotóxico así como antigenotóxico significativo, es decir, la reducción del daño en el ADN inducido por H2O2, tanto en el pre como en el postratamiento, también se observó para el extracto del cuerpo fructífero de T. gibbosa en las siete concentraciones (Figura 2(c)). Sin embargo, a diferencia de los extractos de T. hirsuta, no se observó una respuesta dependiente de la dosis en los extractos de basidiocarpos de T. gibbosa; es decir, una disminución gradual de la concentración del extracto no se correspondió con una reducción proporcional de la genotoxicidad inducida por el H2O2.

Los extractos de micelio de T. versicolor, T. hirsuta y T. gibbosa, en todas las concentraciones analizadas, no tuvieron actividad genotóxica (Figuras 3(a) (A), 3(b) (A) y 3(c) (A)). Todos los extractos y concentraciones de micelio mostraron un efecto antigenotóxico significativo contra el daño al ADN inducido por el H2O2, tanto en el pre como en el postratamiento, y estas actividades no fueron marcadamente diferentes. En T. versicolor, se observó una actividad ligeramente inferior en la concentración más baja del extracto. En T. hirsuta, las concentraciones de 5,0, 2,5 y 20,0 mg mL-1 fueron más eficaces, mientras que en T. gibbosa el mayor efecto protector se observó en una concentración de 2,5 mg mL-1 y el menor en 20,0 mg mL-1 (Figuras 3(a) (B, C), 3(b) (B, C) y 3(c) (B, C)).

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Numerosos compuestos mutagénicos y cancerígenos están presentes en diferentes fuentes naturales . Por otra parte, algunos compuestos naturales podrían ser prooxidantes que causan efectos genotóxicos y/o citotóxicos o antioxidantes, dependiendo de la concentración y la duración de la exposición . Las especies de hongos de alto valor nutricional y medicinal pueden tener diferentes efectos in vitro e in vivo debido a su inestabilidad en condiciones de digestión o a la incapacidad de absorción por el tracto gastrointestinal. Es decir, las actividades obtenidas in vitro no se corresponden necesariamente con las encontradas in vivo. También es importante destacar que los efectos genotóxicos y antigenotóxicos de los extractos de hongos dependen de la especie, la concentración y el ensayo utilizado para su evaluación. Así, nuestros resultados demostraron diferentes capacidades de las tres especies de Trametes para disminuir el daño al ADN inducido por el H2O2; por ejemplo, la actividad más baja se observó en el extracto del cuerpo fructífero de T. hirsuta. Sólo en el extracto del basidiocarpo de T. hirsuta se observó una clara relación dosis-respuesta inversa entre el nivel de daño en el ADN y la concentración del extracto. Sin embargo, en T. versicolor y T. gibbosa, el aumento de la concentración del extracto por encima de la dosis óptima no condujo a ninguna mejora en los resultados del cometa, lo que confirma los resultados de Miyaji et al. Estos autores mostraron la ausencia de una relación dosis-respuesta entre las concentraciones de extracto de Lentinus edodes y su efecto antigenotóxico. Es importante mencionar que la combinación de ingredientes fenólicos, flavonoides y otros en los extractos debería tener un mayor potencial que los componentes individuales de los extractos, lo que indica la importancia de las coacciones de todos los ingredientes . Este hallazgo podría dar lugar a una tendencia diferente de la actividad antigenotóxica de Trametes spp. La dependencia de la actividad genotóxica del extracto en el tipo de ensayo fue demostrada por Morales et al. ; es decir, informaron de la ausencia de efecto mutagénico de los extractos de basidiocarpos de Lactarius deliciosus, Boletus luteus, Agaricus bisporus y Pleurotus ostreatus en células de mamíferos utilizando la prueba Ames de Salmonella/microsoma. Sin embargo, se obtuvo una débil actividad del extracto de P. ostreatus utilizando el ensayo CHO/HPRT.

Los mecanismos subyacentes del efecto antigenotóxico de los extractos de hongos aún no se conocen completamente. Los efectos protectores de los extractos parecen basarse en más de un mecanismo de acción, lo que no es infrecuente en los hongos según Gebhart . Los mecanismos de antigenotoxicidad pudieron ser evaluados mediante aplicaciones de pre y post-tratamientos, es decir, diversas combinaciones de extractos y H2O2. Nuestros resultados positivos en ambos tratamientos indican que los extractos tienen efectos protectores tanto a nivel de prevención como de intervención y que pueden actuar como desmutágenos y bioantimutágenos, como también han demostrado estudios anteriores . La eficacia del pretratamiento, observada en el presente estudio, podría explicarse por el aumento de la capacidad antioxidante de las células, es decir, por la estimulación de la síntesis y la actividad de las enzimas antioxidantes durante la inducción del estrés oxidativo . El efecto positivo del postratamiento podría ser el resultado de la acción sinérgica de las actividades de intervención a través de la eliminación de los radicales libres y la estimulación de las enzimas antioxidantes, así como la excitación de la reparación del ADN, como sugieren Chiaramonte et al. . Dado que estos autores informaron de una reparación significativa del daño en el ADN tras 30-60 min de exposición a un agente oxidativo, podría concluirse que la reparación del ADN desempeñó un papel menos significativo en la protección contra el H2O2, ya que las condiciones de postratamiento consideraron hasta 30 min de incubación. Por lo tanto, la actividad genoprotectora de los extractos de Trametes spp. se basa probablemente en acciones antioxidantes. Por otra parte, se sabe que los organismos eucariotas han desarrollado una vía de señalización, denominada respuesta al daño del ADN, para protegerse de las agresiones al genoma. Gasser y Raulet demostraron que la respuesta al daño del ADN alerta al sistema inmunitario induciendo la expresión de ligandos de la superficie celular para el receptor inmunitario activador NKG2D, que es expresado por las células asesinas naturales (células NK) y algunas células T. Por tanto, la actividad genoprotectora de Trametes spp. en las células expuestas a agentes genotóxicos podría modular la respuesta al daño del ADN y funcionar como barrera en la tumorigénesis temprana. Las investigaciones posteriores deberían incluir el análisis de los niveles de superóxido dismutasa y catalasa en los linfocitos tratados con extractos de Trametes spp., tanto en el pre como en el postratamiento con H2O2, con el fin de confirmar la suposición de que la mejora de la capacidad antioxidante en las células es inducida por dichos extractos.

3.3. Actividad antioxidante Actividad antioxidante

Los extractos de etanol ensayados fueron buenos antioxidantes pero su actividad dependió de la especie. Los extractos de cuerpos fructíferos mostraron efectos de barrido significativamente mayores que los extractos de micelio (). La mayor actividad de barrido de radicales DPPH se detectó en los extractos de T. versicolor, tanto del cuerpo fructífero como del micelio (63,5% y 59,4%, respectivamente), lo que fue confirmado por los valores de EC50 (15,22 mg mL-1 y 16,18 mg mL-1, respectivamente). Se encontró un nivel de actividad ligeramente inferior para los extractos de T. hirsuta (59,0% para los basidiocarpos y 46,8% para el micelio), cuyas concentraciones de 17,06 mg mL-1 y 21,81 mg mL-1, respectivamente, proporcionaron una reducción del 50% de los radicales. T. gibbosa fue la especie con menor potencial de barrido, especialmente de los extractos de micelio (39,7%) con un valor de EC50 de 26,15 mg mL-1. Sin embargo, la capacidad de barrido de radicales del extracto del cuerpo fructífero no fue significativamente menor en comparación con las otras dos especies (53,7% y EC50 de 18,13 mg mL-1). La actividad de barrido del antioxidante sintético BHA fue del 94,28%, y una concentración de 0,10 mg mL-1 proporcionó una reducción del 50%.

El contenido total de fenoles en los extractos del cuerpo fructífero y del micelio de las especies de Trametes fue significativamente diferente () (Tabla 1). En general, el contenido de fenoles en los extractos de cuerpos fructíferos fue mayor que en los extractos de micelio.