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DIAGNOSTICO DE LA DEFICIENCIA DE ALFA-1-ANTITRIPINA POR ANÁLISIS DE ADN DE NIÑOS CON ENFERMEDAD HIGATICA*

Adriana Maria Alves De TOMMASO1, Cláudio Lúcio ROSSI2, Cecília Amélia Fazzio ESCANHOELA3, Heliane Guerra SERRA4, Carmen Sílvia BERTUZZO5 y Gabriel HESSEL6

ABSTRACT ¾ Antecedentes – La deficiencia de alfa-1-antitripsina es un trastorno genético que se transmite de forma codominante y autosómica. La deficiencia de alfa-1-antitripsina afecta principalmente a los pulmones y al hígado, dando lugar, en este último caso, a colestasis neonatal, hepatitis crónica o cirrosis. El diagnóstico preciso de la deficiencia de alfa-1-antitripsina puede obtenerse mediante un análisis bioquímico o molecular. Objetivo – El propósito de este estudio fue utilizar el análisis de ADN para examinar la presencia de una deficiencia de alfa-1-antitripsina en 12 niños en los que se sospechaba esta deficiencia y que mostraban características clínicas y de laboratorio de la enfermedad. Pacientes y métodos – Se estudiaron doce pacientes, con edades comprendidas entre los 3 meses y los 19 años, que presentaban niveles séricos de alfa-1-antitripsina inferiores a los normales y/o tenían una enfermedad hepática de etiología no definida. Se investigaron los alelos mutantes S y Z del gen de la alfa-1-antitripsina en los 12 niños. La organización del gen de la alfa-1-antitripsina se analizó mediante la amplificación del genoma a través de la reacción en cadena de la polimerasa y la digestión con las enzimas de restricción Xmnl (alelo S) y Taq 1 (alelo Z). Resultados – Siete de los 12 pacientes tenían una enfermedad hepática crónica de etiología indefinida y los otros cinco pacientes tenían niveles séricos bajos de alfa-1-antitripsina, así como un diagnóstico de colestasis neonatal y/o enfermedad hepática crónica de etiología indefinida. Cinco de los 12 pacientes eran homocigotos para el alelo Z (ZZ) y dos tenían el alelo S con otro alelo (*S) diferente del Z. Conclusión – Estos resultados muestran que la deficiencia de alfa-1-antitripsina es relativamente frecuente en niños con enfermedad hepática crónica de etiología indefinida y/o niveles bajos de alfa-1-antitripsina (41,6%). Un diagnóstico correcto es importante para un seguimiento clínico eficaz y para el asesoramiento genético.

CABEZAS ¾ Deficiencia de alfa-1-antitripsina. Diagnóstico molecular. Biopsia de hígado.

INTRODUCCIÓN

La alfa-1-antitripsina (A1AT) es una glicoproteína de 52 kDa producida principalmente por los hepatocitos, que liberan 2 g de esta proteína, al día, en el torrente sanguíneo(36). La función principal de la A1AT es inhibir la acción de la elastasa neutrofílica, una proteasa de serina que hidroliza las fibras de elastina en los pulmones(38). Las mutaciones en el gen que codifica para la A1AT producen una proteína sin capacidad inhibidora y pueden dar lugar a la acumulación de A1AT en los corpúsculos de inclusión de los hepatocitos, lo que reduce los niveles séricos normales de esta proteína(4). Esta deficiencia se refleja como enfisema pulmonar, bronquitis crónica o bronquiectasias(9). La acumulación de A1AT mutante en los hepatocitos también puede provocar colestasis neonatal, hepatopatía crónica o cirrosis(33, 34).

El gen A1AT es altamente polimórfico, codominante y está localizado en el brazo más largo del cromosoma 14 (14q 31-32.3)(20, 29). Se han descrito setenta y cinco alelos (designados de la A a la Z según sus puntos isoelétricos) para este gen, basándose en el enfoque isoeléctrico del suero entre el pH 4 (ánodo) y el pH 5 (cátodo) en geles de poliacrilamida. Las variantes comunes migran al centro del gel y, por tanto, pertenecen a la familia M («media»). Una variante deficiente, descrita originalmente por LAURELL y ERIKSSON en 1963(21), migra hacia el cátodo y se denomina Z. Otra variante, que se mueve lentamente en el gel, se denomina S(5). Este «locus» polimórfico se conoce generalmente como sistema Pi (inhibidor de la proteasa). La mayoría de las variantes producen A1AT en cantidad y calidad normales(7, 8, 25). Sin embargo, algunos alelos, como las variantes S y Z, se asocian a un estado deficiente que alcanza frecuencias polimórficas como las poblaciones caucásicas y se han descrito casos de un alelo nulo en el que la producción de la proteína está totalmente ausente(10).

El alelo S resulta de la sustitución de adenina por tiamina en el exón III del gen, lo que lleva a que el ácido glutámico en la posición 264 se intercambie por valina y la consiguiente formación de una estructura proteica inestable(10, 11, 19). El alelo Z resulta de la sustitución de la guanina en la posición 342 por adenina en el exón V del gen y conduce a la formación de una proteína que se acumula en la superficie rugosa interna del retículo endoplásmico del hepatocito(6). El diagnóstico de una condición deficiente suele hacerse tras la cuantificación de los niveles séricos de la proteína junto con el perfil electroforético tras el enfoque isoeléctrico(23, 37). Un diagnóstico más preciso requiere el análisis de genes mediante técnicas basadas en el ADN(12, 14, 26).

El objetivo de este estudio fue identificar a los portadores de los alelos S y Z en pacientes sospechosos de tener esta deficiencia y que mostraban características clínicas y de laboratorio de esta enfermedad.

PATIENTES Y MÉTODOS

Pacientes

Durante el período de febrero de 1988 a agosto de 1997, un gran número de pacientes fueron remitidos al Servicio de Gastroenterología Pediátrica de la Universidad Estatal de Campinas, Campinas, SP, Brasil, para investigar enfermedades hepáticas. De este número sólo 12 pacientes no mostraron ningún diagnóstico definitivo (resultados negativos a la hepatitis viral, hepatitis autoinmune y enfermedad de Wilson). Estos pacientes fueron sometidos a un análisis molecular de la A1AT.

Métodos

1 ¾ Protocolo de estudio

2 – Biopsia hepática

Las biopsias hepáticas percutáneas se obtuvieron según lo descrito por MOWAT(24) utilizando anestesia local en pacientes en ayunas durante al menos 4 h, con venoclisis y actividad de protrombina normal. El fragmento obtenido se colocó inmediatamente en formol al 10% y luego se procesó y se tiñó con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson, azul de Prusia e impregnación de plata de las fibras del retículo. Se obtuvo una tinción especial con PAS (periodic acid-Schiff) seguida de un tratamiento con diastasa. La persistencia de gránulos citoplásmicos con apariencia de eosinófilos, incluso después del uso de diastasa, se consideró positiva para la deficiencia de A1AT.

3 – Análisis molecular

Para investigar los alelos mutantes S y Z de la A1AT, se realizó una extracción de ADN de leucocitos de sangre periférica según el método descrito por WOODHEAD et al.(39).

RESULTADOS

Cinco de los 12 niños estudiados eran homocigotos Z (ZZ) mientras que dos de los niños tenían el alelo S junto con otro alelo que no era Z (*S). La tabla 1 muestra la edad del paciente en el momento de la extracción de sangre y la indicación utilizada para decidir el análisis posterior. Tres de los pacientes presentaron colestasis neonatal como manifestación inicial de la hepatopatía crónica.

La tabla 2 muestra los niveles séricos de ALT, AP, gGT, A1AT, así como los resultados del estudio molecular y de la biopsia hepática.

Los cinco pacientes con el genotipo ZZ tenían niveles séricos de A1AT reducidos y la biopsia hepática mostraba cirrosis (uno), hepatitis neonatal (dos), una escasez de conductos biliares interlobulares (uno) y hepatitis crónica (uno). En este último caso (FSP), se observaron gránulos citoplásmicos de aspecto eosinófilo en los hepatocitos periportales tras la tinción con HE y confirmados posteriormente por la positividad del PAS y la resistencia a la diastasa (figura 1). Los dos pacientes con colestasis neonatal (EKBA y RHBP) fueron sometidos a una biopsia hepática cuando tenían 10 y 13 semanas de edad, respectivamente, y mostraron glóbulos eosinófilos positivos al PAS y resistentes a la diastasa.

Las figuras 2 y 3 muestran los resultados de la amplificación y digestión de los alelos S y Z, respectivamente.

DISCUSIÓN

La deficiencia de alfa-1-antitripsina es uno de los trastornos genéticos más comunes que conducen a la enfermedad hepática en los niños y es la enfermedad genética más común que requiere trasplante de hígado(17, 28). La deficiencia de A1AT afecta a 1 de cada 1.600-2.000 neonatos en Norteamérica y el norte de Europa(28, 31), pero sólo el 10-15% de la población con esta deficiencia desarrolla enfermedades hepáticas(32, 33). Según un estudio publicado por SVEGER en 1988(33), durante el período neonatal el 11% de los pacientes con el fenotipo PIZZ desarrollan hepatitis ictérica. En este estudio, tres pacientes diagnosticados con una deficiencia de A1AT presentaron colestasis neonatal y en dos de ellos, antes de que se estableciera un diagnóstico definitivo de la deficiencia, la colestasis se consideró idiopática. Entre el 5% y el 10% de los casos de hepatitis neonatal idiopática descritos en la literatura están causados por una deficiencia de A1AT(3).

En cinco pacientes con esta deficiencia estudiados, los niveles séricos de A1AT estaban por debajo del límite inferior normal. Sin embargo, esta prueba no confirmó absolutamente el diagnóstico de la enfermedad. Dado que la A1AT es una proteína de la fase inflamatoria aguda, su síntesis aumenta en condiciones inflamatorias/infecciosas, neoplasias, embarazo y durante la terapia con estrógenos y corticosteroides(16, 22). Se produce una reducción de los niveles séricos de A1AT en el síndrome de angustia respiratoria de los neonatos, en la fase terminal de la insuficiencia hepática, en la fibrosis quística y en situaciones en las que hay una gran pérdida de proteínas(15). Los niveles séricos en los genotipos SZ, que teóricamente podrían dar lugar a enfermedades hepáticas, suelen ser normales.

Cuando la colestasis neonatal está presente, es fundamentalmente necesario un diagnóstico diferencial con la atresia biliar extrahepática. La historia clínica permite un diagnóstico adecuado en el 83% de los casos(1) y son necesarias investigaciones específicas para mejorar la precisión del diagnóstico. Entre estas investigaciones, la biopsia hepática es de gran importancia. Las alteraciones histopatológicas observadas en la biopsia hepática de los pacientes con déficit de A1AT pueden ser las mismas que las observadas en la hepatitis neonatal idiopática o en los casos de atresia biliar extrahepática(24). La presencia de glóbulos intrahepatoquísticos predominantemente periportales que son fuertemente positivos al PAS tras la digestión con diastasa es una indicación útil de la deficiencia de A1AT(13, 18, 27). Sin embargo, es difícil identificar estos glóbulos antes de la 12ª semana después del nacimiento(35). En este estudio, el paciente EKBA presentaba glóbulos con las características mencionadas en el tejido hepático a las 10 semanas de vida. No se observaron tales glóbulos en el paciente JCI (13 semanas de edad). Estos resultados sugieren que debe investigarse la presencia de glóbulos mediante una tinción especial en los fragmentos hepáticos obtenidos antes de las 12 semanas de edad, aunque un resultado negativo no elimina la posibilidad de una deficiencia de A1AT. En este estudio no se utilizó el análisis bioquímico, ya que era posible el análisis del ADN, que es más preciso.

Una deficiencia de A1AT es relativamente frecuente en niños que tienen una enfermedad hepática de etiología no definida. Este diagnóstico está subestimado, probablemente porque se utilizan métodos de diagnóstico imprecisos. El análisis molecular proporciona un diagnóstico más preciso y también puede ser útil para el asesoramiento genético de los pacientes con enfermedad hepática de etiología desconocida.

De Tommaso AMA, Rossi CL, Escanhoela CAF, Serra HG, Bertuzzo CS, Hessel G. Diagnóstico da deficiência de alfa-1-antitripsina por estudo molecular em crianças com doença hepática. Arq Gastroenterol 2001;38(1):63-68.

RESUMEN – Racional – La deficiencia de alfa-1-antitripsina es una enfermedad genética que se transmite de forma autóctona y codominante. Las principales manifestaciones clínicas incluyen acometimiento pulmonar y hepático. Esta última se presenta como colestasis neonatal, hepatitis crónica o cirrosis. El diagnóstico definitivo se realiza mediante el análisis bioquímico de la alfa-1-antitripsina o el análisis molecular. Objetivo – Investigar, en un grupo de 12 niños con sospecha de deficiencia de alfa-1-antitripsina, la presencia efectiva de la deficiencia a través del análisis de ADN, para un diagnóstico definitivo, así como la asociación entre las deficiencias de alfa-1-antitripsina con las características clínicas y de laboratorio encontradas. Casuística y métodos – Se investigaron los alelos mutantes S y Z del gen de la alfa-1-antitripsina en 12 pacientes con edades comprendidas entre los 3 meses y los 19 años, remitidos por el Ambulatorio de Gastroenterología Pediátrica de la Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasil, por presentar niveles séricos de alfa-1-antitripsina inferiores a los normales y/o enfermedad hepática sin etiología definida. El análisis del ADN se realizó mediante el método de amplificación génica de la reacción en cadena de la polimerasa modificado que crea sitios de restricción para las enzimas Xmnl (alelo S) y Taq l (alelo Z). Resultados – De los 12 pacientes remitidos, 7 tenían una hepatopatía crónica sin etiología definida y los otros 5 tenían dosis bajas de alfa-1-antitripsina sérica acompañadas de un diagnóstico de colestasis neonatal y/o hepatopatía crónica de etiología desconocida. En este grupo de 12 pacientes, se observaron cinco pacientes homocigotos Z (ZZ) y dos portaban el alelo S acompañado de otro alelo, diferente del Z (*S). Conclusión – Estos resultados muestran que la deficiencia de A1AT es una etiología relativamente frecuente en los niños que presentan una enfermedad hepática crónica sin etiología definida y/o una dosis baja de A1AT en suero (41,6%). La importancia de un diagnóstico de certeza para la deficiencia se justifica no sólo para el seguimiento clínico del paciente sino también, en términos de asesoramiento genético.

DESCRITORIOS ¾ Deficiencia de alfa-1-antitripsina. Diagnóstico molecular. Biopsia de hígado.

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Recibido el 3/11/1999.
Aprobado en 6/11/2000.

* Estudio realizado por los Departamentos de Pediatría, Genética Médica, Anatomía Patológica y Patología Clínica de la Facultad de Ciencias Médicas (FCM), Universidad Estatal de Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brasil.

1 Estudiante de postgrado. Departamento de Pediatría, FCM/UNICAMP.

2 Profesor Adjunto. Departamento de Patología Clínica, FCM/UNICAMP.

3 Profesor Adjunto. Departamento de Anatomía Patológica, FCM/UNICAMP.

4 Doctorado en Genética (Instituto de Biología), UNICAMP.

5 Profesor Adjunto. Departamento de Genética Médica, FCM/UNICAMP.

6 Profesor Adjunto. Departamento de Pediatría, FCM/UNICAMP.